新型結(jié)核診斷抗原和生物標(biāo)志物的篩選及其在結(jié)核病診斷中的應(yīng)用.pdf

1、建立在細(xì)胞免疫基礎(chǔ)上的γ干擾素釋放實驗(IFN-gamma release assays，IGRAs)近年來獲得了較快的發(fā)展，IGRAs通過對結(jié)核分枝桿菌特異性的抗原刺激后的IFN-γ釋放進(jìn)行檢測來判斷機體是否存在結(jié)核菌的感染。目前商品化的IGRAs共有兩種，一種為QuantiFERON TB Gold In-Tube test(QFT; cellestis，Carnagie，Australia)，另一種為T-SPOT.TB test(

2、Oxford Immunotech，Abingdon，UK)。IGRAs在結(jié)核病的臨床檢測中獲得了一定程度的應(yīng)用，與傳統(tǒng)的結(jié)核菌素試驗(Tuberculin skin test，TST)相比較，IGRAs在BCG廣泛接種地區(qū)具有較低的假陽性率并且與結(jié)核病的高危因素具有較高的相關(guān)性。但現(xiàn)有的IGRAs仍然存在諸多缺陷，限制了其在結(jié)核病診斷中的應(yīng)用，主要集中在敏感性仍然有待提高，以及會出現(xiàn)較多無法判定的結(jié)果，特別是在重癥結(jié)核和伴有免疫抑制的

3、結(jié)核病患者中。此外，目前的IGRAs只能夠檢測結(jié)核桿菌的感染，而不能夠區(qū)分活動性結(jié)核和潛伏性結(jié)核感染。在結(jié)核病高流行的地區(qū)和國家，由于潛伏性結(jié)核感染的比率較高，使IGRAs的在臨床診斷中的應(yīng)用受到了極大地限制。為了改進(jìn)現(xiàn)有的IGRAs診斷方法，一方面可以增加結(jié)核桿菌特異性的抗原，另一方面可以檢測除IFN-γ以外的其它診斷標(biāo)志物。
　　本研究首先在結(jié)核桿菌基因組的RD區(qū)中篩選新的結(jié)核桿菌特異性抗原。結(jié)核桿菌基因組的RD區(qū)(Regio

4、n of differentiation)在BCG和絕大多數(shù)非結(jié)核分枝桿菌中是缺失的，RD區(qū)是結(jié)核桿菌免疫診斷特異性抗原篩選的首選區(qū)域。在前期研究中，通過對RD2及RD11抗原的體外表達(dá)和純化得到RD2區(qū)和RD11區(qū)抗原的重組蛋白，對其診斷價值進(jìn)行了初步的篩選。本研究對其中具有最高診斷價值的抗原Rv1985c和Rv3425進(jìn)行了的T細(xì)胞抗原表位的作圖和分析。應(yīng)用基于全血的IFN-γ釋放實驗，我們以覆蓋Rv1985c和Rv3452氨基酸序

5、列全長的多肽作為抗原，在活動性結(jié)核病人，潛伏性結(jié)核感染者和BCG接種的健康對照中對其表位進(jìn)行了篩選，從中選取特異性抗原表位多肽組成多肽混合物，并進(jìn)一步進(jìn)行驗證。結(jié)果表明在我們所選取的多肽混合物中，Rv1985cpool2，Rv1985cpool4和Rv3425pool1均具有較高的診斷價值，敏感性最高為53.9％，特異性為95.5％。將這些多肽混合物與QFT聯(lián)用能夠提高診斷的敏感性從86.4％到96.2％，而不影響診斷的特異性。因此，本

6、部分研究的結(jié)果表明應(yīng)用表位作圖方法篩選出的特異性Rv1985c和Rv3425的抗原表位多肽對結(jié)核病具有較高的診斷價值，可以在BCG接種人群中應(yīng)用于結(jié)核病的診斷。
　　另一方面為了篩選新的診斷生物標(biāo)志物，我們應(yīng)用高通量的懸液芯片技術(shù)，在28例活動性結(jié)核病人，34例潛伏性結(jié)核感染者及26例健康對照者中，對外周全血受結(jié)核特異性抗原刺激及基礎(chǔ)分泌水平的27種炎癥因子譜進(jìn)行了分析和篩選。結(jié)果表明結(jié)核特異性抗原刺激后的IFN-γ，IP-10，

7、IL-2，MCP-1，IL-1RA，IL-15和未受抗原刺激的VEGF，IP-10，IL-12，MCP-1，MIP-1b釋放量在結(jié)核感染組（包括活動性結(jié)核和潛伏性結(jié)核感染）中均明顯高于健康對照組。在27種炎癥因子中，基礎(chǔ)分泌水平的VEGF，PDGF，IL-12，IP-10和結(jié)核特異性抗原刺激后的IFN-γ和PDGF在活動性結(jié)核組中明顯高于潛伏性結(jié)核感染組。當(dāng)聯(lián)合應(yīng)用VEGF，IL-12和PDGF能夠區(qū)分活動和潛伏性結(jié)核感染，其敏感性和特

8、異性分別為79.4％和92.9％。這些結(jié)果表明，建立在現(xiàn)有IGRAs基礎(chǔ)上通過對VEGF，IL-12和PDGF等進(jìn)行檢測可以作為一種新的快速診斷方法，能夠應(yīng)用于區(qū)分活動性結(jié)核病和潛伏性結(jié)核感染。5接下來本研究選取前期篩選出的具有較高診斷價值的標(biāo)志物IP-10和IL-2，進(jìn)一步驗證并評價其在結(jié)核高流行，BCG廣泛接種地區(qū)診斷結(jié)核病的表現(xiàn)。我們共收集了活動性結(jié)核病人66例，潛伏性結(jié)核感染者73例和健康對照77例，對其外周全血受結(jié)核特異性抗原

9、刺激后的IP-10和IL-2釋放量進(jìn)行了檢測。結(jié)果表明，IFN-γ，IP-10和IL-2在活動性結(jié)核組中診斷的陽性率分別為86.4％，89.4％和86.4％，在潛伏性結(jié)核感染組中為38.4％，57.5％和39.7％，在健康對照組中為17.1％，18.4％和14.5％。在活動性結(jié)核病人的密切接觸者中，與TST相比較，IP-10和IL-2與結(jié)核感染的高危因素具有較高的相關(guān)性。此外IP-10和IL-2的聯(lián)用可以降低出現(xiàn)無法判定結(jié)果的幾率。IP

10、-10和IL-2與QFT聯(lián)用可以將敏感性提高到95.5％而并不影響特異性，無法判定結(jié)果比率下降為0.4％。此外，我們還發(fā)現(xiàn)IL-2/IFN-γ能夠區(qū)分活動性結(jié)核病和潛伏性結(jié)核感染，其敏感性為77.2％，特異性為87.2％。
　　綜上所述，本研究一方面確定了Rv1985c和Rv3425兩個抗原的特異性的T細(xì)胞表位多肽，并證實了其在診斷結(jié)核病中應(yīng)用價值和對現(xiàn)有抗原的補充作用。另一方面，本研究也通過懸液芯片技術(shù)篩選出了能夠區(qū)分活動性結(jié)核