分子診斷技術在結(jié)核病診治中的應用

1、分子診斷技術在結(jié)核病診治中的應用,武漢大學人民醫(yī)院檢驗醫(yī)學中心李 艷,全球結(jié)核病流行狀況,WHO report，2013,,全球結(jié)核病流行狀況,,全球結(jié)核感染人數(shù)2004年后處于下降趨勢HIV患者并發(fā)結(jié)核病數(shù)量處于平穩(wěn)階段中國結(jié)核感染人數(shù)全球排名第二,WHO report，2013,全球結(jié)核病流行狀況,,WHO report，2013,,全球結(jié)核病流行狀況,全球結(jié)核死亡人數(shù)處于下降趨勢斯威士蘭結(jié)核病感染率最高,WHO repo

2、rt，2013,全球結(jié)核病流行狀況,Globally, an estimated 3.6% of new cases and 20.2% of previously treated cases have MDR-TBThere were an estimated 450,000 new cases of MDR-TB worldwide in 2012On average, an estimated 9.6% of MDR-TB c

3、ases have XDR-TB,WHO report，2013,全球結(jié)核病流行狀況,2012年全球新發(fā)結(jié)核病例為860萬人，中國占總數(shù)的12%在860萬新病例中約110萬人（13%）為HIV陽性，這些病例的75%在非洲 每年約有130萬人死于結(jié)核病，我國為25萬 結(jié)核病每24秒鐘就殺死1人 預計未來20年還將有3600萬人死于結(jié)核病。 全球每年有45萬新發(fā)MDR-TB，大約4.3萬為 XDR-TB,“4多”,WHO re

4、port，2013,,,,,,,,,,結(jié)核病診治中存在的問題,,,,,,,預防問題,,診斷問題,治療問題,醫(yī)療問題,檢驗人員最關心的問題,根據(jù)不同分子水平及技術特點來選擇診斷檢測體系,方法選擇,方法選擇的影響因素,Sputum,,涂片,MTB培養(yǎng)—孵育4-8周（陽性）,藥敏試驗—觀察 孵育4周觀察生長情況,涂片 （陽性）,分子診斷技術,液體培養(yǎng)及藥敏試驗,,,,,,平均時間2-3個月,,平均時間20天,,只需2小時-2天,涂陽=6

5、0-98%有結(jié)核分枝桿菌，因此涂陽后最好用分子生物學方法進行快速鑒定,,,擴增 雜交,LAMP、SDA,芯片、RT-PCR,,,SAT、TMA,FISH、Probe,分子診斷適宜技術的選擇,T-SPOT.TB與 QFT-GI為IGRAs實驗,結(jié)核菌素試驗（TST）,T-SPOT.TB,QuantiFERON-TB Gold in-tube (QFT-GI),,蛋白質(zhì)水平,全血IFN-γ釋放分析技術(IGRA)

6、,結(jié)核感染者體內(nèi)存在特異的效應T淋巴細胞，效應T淋巴細胞再次受到結(jié)核抗原刺激時會分泌多種細胞因子（IFN-γ）。因此，檢測效應T淋巴細胞可用于結(jié)核病或結(jié)核潛伏感染者的診斷。由于效應T細胞存活時間很短，而且具有特異性，因此可以作為機體是否正處于被感染的指標，無論是否有臨床癥狀。基于IGRA原理的產(chǎn)品目前已被美國、加拿大、英國、德國、意大利、瑞士、法國、荷蘭、日本等二十余個國家寫入本國的結(jié)核診療指南中,,,γ-干擾素釋放實驗,酶聯(lián)免疫斑

7、點技術,培養(yǎng)濾液蛋白10（CFP 10）,早期抗原靶6（ESAT-6）,,,,一、T-SPOT技術基礎,T-SPOT,由結(jié)核桿菌基因組RD1區(qū)相同的操縱子編碼的蛋白所有的卡介苗（BCG）均丟失該基因序列絕大多數(shù)的環(huán)境分枝桿菌也不存在RD1區(qū),結(jié)核桿菌特異抗原,,ESAT-6與CFP 10抗原,,PlamaPBMCsGel BarrierErythrocytes,,,檢測過程,分離PBMCs,加入PBMCs與結(jié)核特異抗原

8、37℃孵育16-20小時,PBMCs特異抗原,Γ-干擾素抗體,加入標記二抗，孵育1小時,,加入顯色液，終止反應,,觀察結(jié)果：1個斑點=1個效應T細胞,結(jié)果判斷圖,,陰性結(jié)果,陽性結(jié)果,空白對照抗原 AESAT-6抗原 BCFP10陽性對照（PHA）,,,,,,,,,,,潛伏性結(jié)核（LTBI）診斷技術比較,,IGRAs與TST相比，具有更高的靈敏度和特異性IGRAs與BCG, NTM無交叉反應，TST有交

9、叉反應,難以從感染者中鑒別出活動性肺結(jié)核患者小于5歲兒童、免疫力低下患者不適合采用IGRAs檢測試劑成本非常高,,costs（費用） availability for clinicians and other health workers（醫(yī)療水平） patient acceptability（患者是否接受）ease of distribution and storage（實驗平臺）,,,核酸擴增技術,S

10、AT：Simultaneous Amplification and Testing (RNA仁度) CPA: Cross Priming Amplification (DNA/RNA,優(yōu)思達)LAMP:Loop-Mediated Isothermal Amplification (DNA, Japan)TMA: Transcription Mediated Amplification (RNA, Gen-Probe),Gen

11、oType® MTBDRplus：(Hain Lifescience) NASBA: Nucleic Acid Sequence-Based Amplification (RNA,OT) RCA: Rolling Circle Amplification (DNA, Molecular Staging) HDA：Helicase-Dependant Amplification (DNA, Biohelix, NEB),,

12、,,,,,,RNA 拷貝數(shù)≥ DNA拷貝數(shù),,生命力旺盛的病原體RNA轉(zhuǎn)錄活躍,,,,較好的愈后指標,,,交叉污染少,,TMA、SAT優(yōu)點,RNA作為臨床分子診斷靶標,二、SAT技術,同一溫度下（42℃），以RNA為起始模板，通過M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶產(chǎn)生一個雙鏈DNA拷貝，然后利用T7 RNA多聚酶從DNA拷貝上產(chǎn)生多個（100～1000個）RNA拷貝；每一個RNA拷貝再從反轉(zhuǎn)錄開始進入下一個擴增循環(huán)；同時，帶有熒光標記的探針和這些RNA

13、拷貝特異結(jié)合，產(chǎn)生熒光。該熒光信號可由熒光檢測儀器實時捕獲，直觀反映擴增循環(huán)情況,TB-SAT操作步驟,陽性結(jié)果,陰性結(jié)果,恒溫擴增 --42°CRNA 檢測 --起始靶標與擴增產(chǎn)物都是RNA擴增產(chǎn)物的污染更少 --RNA環(huán)境中易降解更高的擴增效率--30分鐘內(nèi)擴增10億倍反應穩(wěn)定 -- 抑制物少,高靈敏度、特異性活菌檢測操作簡單、快速,,,MTBDRsl-鑒定XDR,MTBDRplus-鑒定MDR,MTBC-鑒定

14、MTB復合群,MTBCM-鑒定MTB和NTM,分類,Gene-Probe(TMA/Hain)技術,三、MTBC-鑒定MTB復合群(TMA技術),方法名稱： HPV（Hybridization Protection Assay）-雜交保護分析法為Gen-probe公司專利原理： 以rRNA為靶標，采用線性探針技術檢測結(jié)核分枝桿菌復合群檢測設備： LEADER 50iHPA-MTD(Mycobacteriu

15、m Tuberculosis Direct): 2.5h 報告，直接從標本中檢測結(jié)核菌HPA-Accuprobe: <1h 報告，用菌落或自動培養(yǎng)系統(tǒng)的菌,樣本,,細胞溶解,目標 r-RNA釋放,MTD技術路線,雜交體,rRNA,60°C15分鐘,,加入探針,探針,,雜交,,選擇性試劑,60°C,化學發(fā)光讀數(shù)儀,,熒光檢測,MTD技術特點,MTD結(jié)核分枝桿菌檢測技術特點,采用分子技

16、術快速鑒定（2.5小時）結(jié)核分枝桿菌復合群標本可以是涂片陰性或者陽性的痰標本；也可以是培養(yǎng)物唯一獲得FDA推薦的凃陰樣本快速檢測技術檢測RNA，RNA只能來源于活的細菌，可鑒定活動性結(jié)核病人）采用TMA恒溫擴增，不使用PCR儀器，無需專業(yè)的PCR實驗室認證HPA雜交保護分析技術：靈敏、特異嚴格的實驗室防污染技術：整個實驗過程所有試劑和樣本全部在同一個反應管內(nèi)進行，杜絕交叉污染,MTD結(jié)核分枝桿菌的直接檢測意義,TB與其他分枝

17、桿菌區(qū)分 AIDS患者鳥分枝桿菌小腸黏膜感染 龜分枝桿菌引起嚴重院內(nèi)感染（南方某醫(yī)院）提高TB檢出率 CSF、胸腹水等疑似患者 長期低熱、ESR持續(xù)增快，排除腫瘤和免疫性疾病患者，做血、痰TB菌MTD檢測,DNA作為臨床分子診斷靶標,,四、MTBDRplus-鑒定MDR,方法名稱： 耐多藥結(jié)核病(MDR-TB)快速診斷為Hain Lifescience公司專利原理： 采用線性探針技術

18、（Line-Probe或稱DNA-Strip）檢測結(jié)核分枝桿菌復合群利福平(rpoB)和異煙肼(katG和inhA)等結(jié)核治療藥物的耐藥基因來判斷TB體內(nèi)耐藥性MTBDRplus: 6h報告結(jié)核分枝桿菌復合群鑒定與耐藥結(jié)果,結(jié)核耐藥的分子機制,,MTBDRplus技術路線,結(jié)果解釋,野生型：有雜交帶顯色為“+”，表示未發(fā)生突變 耐藥突變位點：有雜交帶顯色為“+”，表示發(fā)生突變 敏感：所有野生型探針“+”和所有耐藥位點探針

19、“-” 耐藥：對應藥物有1條野生型探針“-”或有1條耐藥位點“+”,,,技術特點,MTBDRplus技術,MTBDRplus技術性能參數(shù),J Clin Microbiol. 2010 Aug;45(8):2635-40. Epub 2007 May 30,MTBDRplus技術性能參數(shù),,中國人群存在一定數(shù)量的KatG S315N突變,,WHO、蓋茨基金會推薦使用的快速線性探針技術，可以在6小時內(nèi)給出藥敏鑒定結(jié)果可以做一線結(jié)核藥物（

20、異煙肼 利福平）、二線結(jié)核藥物的耐藥檢測（乙胺丁醇、氟喹諾酮類藥物、可注射結(jié)核藥物）標本可是涂片陽性的痰標本，或是培養(yǎng)物技術步驟簡單：核酸提取、PCR擴增、核酸雜交儀檢測每個試劑條上自帶質(zhì)控：CC雜交質(zhì)控、AC擴增質(zhì)控、TUB結(jié)核分枝桿菌質(zhì)控，確保整個實驗流程的可信度,HAIN-結(jié)核分枝桿菌耐藥快速檢測系統(tǒng)特點,五、交叉引物恒溫擴增技術 (Cross Priming Amplification, CPA),本試劑盒將病原體DN

21、A擴增、核酸雜交和核酸試紙條檢測三種技術有機地融為一體，在恒溫擴增反應中加入兩對TB特異性引物、一對特異性探針，同時一次性完成TB DNA的擴增及雜交過程，然后用3號一次性核酸檢測裝置對TB感染進行定性診斷，其檢測靈敏度為10個病原體，高特異引物設計確保了結(jié)果的可靠性。由于待測樣本的擴增（PCR管蓋和石蠟油雙重保護）和檢測過程均在物理封閉條件下完成，所以本試劑盒具有防止實驗室擴增物交叉污染，防止假陽性的效果,杭州優(yōu)思達公司,CPA技術原

22、理圖,A:引入交叉引物位點,B:交叉引物擴增,C:檢測產(chǎn)物,CPA技術路線圖,,,,,,,,,,,,有色顆粒,抗A抗體,,雙重標記的特異性擴增物,陽性,,,,,Ａ,,,抗Ｂ抗體,,試紙條檢測結(jié)果判讀原理圖,,Ｂ,,結(jié)果的判讀,陽性：試紙條出現(xiàn)兩條紅色條帶，一條位于質(zhì)控區(qū)（C線），一條位于檢測 區(qū)（T線）且其強度≥L4（與附帶的色卡比較）。表明樣本中含有結(jié)核分枝桿菌，且其水平達到或超過本試劑盒的最低檢出限 陰性：試紙條質(zhì)控區(qū)（C線）

23、出現(xiàn)一條紅色條帶，檢測區(qū)（T線）沒有條帶或者其強度＜L4（與附帶的色卡比較）。表明樣本中不含結(jié)核分枝桿菌，或其水平低于本試劑盒的最低檢出限 無效：試紙條質(zhì)控區(qū)（C線）未出現(xiàn)條帶。表明試劑盒已損壞、失效或者操作有誤,恒溫擴增-CPA,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,CPA的優(yōu)勢：快速，簡單，靈活，穩(wěn)定,Affordable低價: 不需昂貴的設備和分子實驗室,Sensitive靈敏：10個菌/ml；與快培比較：87%,Speci

24、fic特異：能鑒別人型和牛型結(jié)核分枝桿菌,User-friendly容易使用：不需PCR儀, 操作簡單,Rapid/robust快速/穩(wěn)定：樣本到結(jié)果2小時,Equipment-free無儀器：僅需離心機、水浴鍋或金屬浴,Deliverable易儲運：不需冷鏈運輸。裝置可儲存于室溫,,,,ASSURED,,CPA技術性能參數(shù),,六、環(huán)介導恒溫擴增技術 (Loop-Mediated Isothermal Amplifi

25、cation，LAMP ),環(huán)介導恒溫擴增法是日本榮研化學獨立研發(fā)的一種“簡便、快速、準確、廉價”的基因擴增方法。它的特征是針對目標DNA鏈上的六個區(qū)段設計四個不同的引物，然后再利用鏈置換反應在一定溫度下進行反應。反應只需要把基因模板、引物、鏈置換型DNA合成酶、基質(zhì)等共同置于一定溫度下（60-65）、經(jīng)一個步驟即可完成。擴增效率極高，可在15min-1h內(nèi)實現(xiàn)109-1010倍的擴增。而且由于有著高度的特異性，只需根據(jù)擴增反應產(chǎn)物的有

26、無可對靶基因序列的存在與否作出判斷,不需要使雙鏈DNA先變性成單鏈 擴增反應在等溫下可持續(xù)進行 擴增效率極高 針對六個區(qū)段使用兩種不同的引物，可特異性擴增靶基因序列 僅使用一種鏈置換DNA聚合酶，成本低廉 擴增產(chǎn)物是在同一條DNA鏈上互補序列周而復始形成大小不一的結(jié)構(gòu) 當模板是RNA時，僅需加入逆轉(zhuǎn)錄酶即可與DNA一樣進行擴增,LAMP技術原理動畫圖,LAMP方法建立階段所需的試劑,DNA 擴增

27、 RNA擴增,模板DNA引物FIPF3BIPB3BstDNA 聚合酶dNTPs反應緩沖液,模板RNA引物FIPF3BIPB3BstDNA 聚合酶逆轉(zhuǎn)錄酶dNTPs反應緩沖液,LAMP技術結(jié)果判讀原理圖,LAMP法結(jié)果判斷方式?----目視檢查混濁,LAMP法結(jié)果判斷方式?/?----目視檢查綠色熒光/濁度檢測儀,擴增反應在等溫條件（60～65℃）下連續(xù)進行

28、?可以使用簡便、廉價的擴增裝置 擴增效率高、可在短時間內(nèi)完成擴增 ?可在短時間內(nèi)得出結(jié)果 有非常高的特異性 ?可得出“擴增反應發(fā)生=有目的菌存在”的結(jié)論 產(chǎn)生大量擴增產(chǎn)物，檢測方法簡便 ?無需用電泳、特殊探針等，可通過濁度儀、熒光目視 方法確認擴增結(jié)果 從擴增到檢測可在1個反應試管內(nèi)（封閉系統(tǒng)）完成 ?可防止由于擴增產(chǎn)物產(chǎn)生的污染 從RNA經(jīng)一步反應可完成擴增

29、 ?無需另外進行逆轉(zhuǎn)錄反應,小結(jié),LAMP技術特點,LAMP技術的應用領域,,,,,,,食品領域?食物中毒致病菌的檢測?食品的衛(wèi)生管理?食物中毒的防止,臨床領域?病原菌、病毒的檢測及鑒定?通過SNP多態(tài)性分型決定用藥量,農(nóng)業(yè)領域?植物病害的早期發(fā)現(xiàn)及蔓延防止?轉(zhuǎn)基因作物的檢測,環(huán)境領域?環(huán)境、水中病原微生物的檢測,工業(yè)領域?工業(yè)產(chǎn)品用大量DNA的生產(chǎn)成為可能,畜牧業(yè)領域?雌雄性別判斷?病原微生物的檢測?遺傳病的

30、發(fā)現(xiàn),LAMP技術性能參數(shù),,七、DNA微陣列（基因芯片）技術,DNA微陣列或芯片技術是利用光導化學合成、照相平板印刷以及固相表面化學合成等技術，在固相表面合成成千上萬個寡核苷酸探針，或?qū)⒁合嗪铣傻奶结樣晌㈥嚵衅骰驒C器人點樣于尼龍膜或硅片上，再與放射性同位素或熒光物標記的DNA或cDNA雜交，用于分析DNA突變及多態(tài)性、DNA測序、監(jiān)測同一組織細胞在不同狀態(tài)下多種組織細胞基因表達水平的差異、發(fā)現(xiàn)新的致病基因或疾病相關基因等多個研究領域,

31、博奧生物,基因芯片技術操作流程,,,,,樣品制備,試劑配制,雜交,激光共焦掃描,軟件判讀,分枝桿菌菌種鑒定試劑盒（DNA微陣列芯片法）同時快速檢測 17 種分枝桿菌：結(jié)核、胞內(nèi)、鳥、戈登、堪薩斯、偶然、瘰疬、淺黃、土、龜-膿腫、草、不色、海-潰瘍、金色、蘇爾加、蟾蜍及恥垢。分離株或者痰樣本均可檢測。 通 量：同時檢測 17 種分枝桿菌速 度：6小時 versus 傳統(tǒng) 4 周靈敏度： 103 CFU/反應特異性

32、：防污染體系；對照設計嚴謹；自動判讀結(jié)核分枝桿菌耐藥基因檢測試劑盒（DNA微陣列芯片法）基于rpoB/katG/inhA的基因突變，快速檢測分離株或者痰樣本中結(jié)核分枝桿菌多藥耐藥（利福平、異煙肼）通 量：兩種一線抗結(jié)核藥物、8個突變位點速 度：6小時versus 傳統(tǒng) 4~8 周靈敏度： 103 CFU/反應特異性：防污染體系；對照設計嚴謹；自動判讀,基因芯片技術特點,基因芯片技術性能參數(shù),分枝桿菌菌種鑒定試劑盒（

33、DNA微陣列芯片法） 結(jié)核分枝桿菌耐藥基因檢測試劑盒（DNA微陣列芯片法） （基因芯片診斷耐多藥結(jié)核病的臨床多中心研究） 基因芯片檢測和DNA測序結(jié)果的符合率為100%絕對濃度法藥敏結(jié)果作為標準，基因芯片法檢測利福平、異煙肼耐藥和耐多藥的符合率分別是93.7