結核分枝桿菌抗原的制備及其在診斷中的應用.pdf

1、目的：目前結核病的檢測方法多種多樣，免疫學檢測方面主要包括基于細胞免疫的檢測方法和基于體液免疫的檢測方法?；诩毎庖叩臋z測包括皮膚試驗和細胞因子的檢測?；隗w液免疫的檢測包括抗原檢測和抗體檢測。免疫學檢測獲得較高敏感性和特異性的關鍵在于抗原的選擇，選擇出特異性好，敏感性高的結核分枝桿菌抗原在結核病檢測方面具有重要意義。本課題主要是對結核分枝桿菌 RD1區(qū)多種和Rv3452抗原進行制備，并研究制備出的結核分枝桿菌抗原在結核病診斷中的應用

2、價值。
　　方法：根據文獻報道，從TB databases數據庫（http://tb.lanl.gov/content/index）下載結核分枝桿菌H37Rv菌株RD1區(qū)及Rv3452抗原的核苷酸序列和氨基酸序列。運用 Biosun生物軟件分析 RD1區(qū)及 Rv3452抗原表位分布情況，篩選峰值較高表位區(qū)段，而后截取其相應氨基酸序列和基因序列設計引物，采用分子克隆技術克隆相應基因，分別構建原核表達載體，誘導表達并純化抗原，建立間接

3、 ELISA方法，檢測患者血清中相應IgG抗體的水平。
　　結果：通過原核表達載體，共成功獲得了5種 RD1去抗原、全長 Rv3452抗原和Rv3452-2區(qū)段抗原。在初步篩選出特異性和敏感性比較好的抗原的基礎上擴大檢測樣本，并把樣本進行分組。本實驗所用樣本分為三組，第一組為涂片和培養(yǎng)共同陽性組（83例），第二組為涂片陰性且培養(yǎng)陽性組（48例），第三組為涂片和培養(yǎng)共同陰性組（79例）。通過間接ELISA法進行檢測，結果顯示7個抗原

4、敏感性分別為56.19％、26.67%、65.7%、58.57%、60.48%、70.85%和65.24%。Rv3871、Rv3874、Rv3875、Rv3876、Rv3879、Rv3452和Rv3452-2抗原痰培養(yǎng)陽性組的檢出率分別為54.19%、59.54%、27.48%、54.96%、55.73%、70.8%和58.7%。Rv3871、Rv3874、Rv3875、Rv3876、Rv3879、Rv3452和Rv3452-2抗原對痰

5、涂片檢測為陰性組的檢出率分別為62.21%、73.22%、25.98%、58.26%、66.92%、69.29%和69.29%。Rv3871、Rv3874、Rv3875、Rv3876、Rv3879、Rv3452和Rv3452-2抗原對痰培養(yǎng)陰性組的檢出率為59.49%、78.48%、25.31%、65.82%、68.35%、70.88%和75.94%。Rv3871、Rv3874、Rv3875、Rv3876、Rv3879、Rv3452和R

6、v3452-2抗原血清學法檢測檢出率分別為56.19%、65.7%、26.67%、58.57%、60.48%、70.85%和65.24%。而對相同的樣本涂片法的檢出率為39.52%，培養(yǎng)法的檢出率為62.38%。結果比較可得 CFP-10（Rv3874）、Rv3452和Rv3452-2三個抗原的檢出率高于培養(yǎng)法的檢出率，同時這七個抗原除ESAT-6（Rv3875）抗原外其它抗原的檢出率均高于涂片法的檢出率。為了了解臨床治療過程中患者的I

7、gG抗體變化水平并評價這些抗原在抗結核治療效果評價中的應用價值，我們選取了88例治療過程中的活動性肺結核患者的系列血清，分別為治療0個月、2個月、4個月和6個月的血清樣本。對以上標本中IgG抗體水平變化進行檢測。結果顯示7種抗原在88例結核病患者血清樣本中的檢出率分別為69.3%、73.8%、51.1%、84.1%、71.5%、68.1%和67.1%。其中 OD值水平下降的患者所占的比率分別為47.5%、44.6%、40%、37.8%、

8、31.7%、48.3%和45.7%。OD值上升的患者所占的比例分別為27.8%、35.7%、40%、31.1%、39.6%、40%和30.5%。OD值不變的患者所占的比例分別為24.6%、20%、20%、31.1%、28.5%、11.6%和23.7%，由此結果可得治療過程中IgG抗體下降的患者所占的比例較大。
　　結論：結核病患者體內存在針對 RD1區(qū)和Rv3452不同抗原的特異性抗體，而且不同抗原之間存在互補性。結核病患者體內抗