結(jié)核分枝桿菌甲基化肝素結(jié)合血凝素的表達(dá)及其在結(jié)核病免疫診斷中的應(yīng)用.pdf

1、目的:
　　本研究旨在恥垢分枝桿菌（Mycobacterium smegmatis，M.smegmatis）中表達(dá)與純化甲基化肝素結(jié)合血凝素蛋白(methylated heparin-binding haemagglutininadhesin，mHBHA)，研究mHBHA在鑒別診斷潛伏結(jié)核感染(latent tuberculosisinfection，LTBI)和活動(dòng)性結(jié)核病(active tuberculosis，ATB)中的價(jià)

2、值，以及評(píng)估m(xù)HBHA在結(jié)核病血清學(xué)診斷中的價(jià)值。
　　方法:
　　1、利用PCR方法從Mycobacterial tuberculosis(M.tb) H37Rv基因組中擴(kuò)增HBHA編碼基因，克隆到分枝桿菌穿梭表達(dá)質(zhì)粒pMFA41中，構(gòu)建pMFAH41原核表達(dá)質(zhì)粒，然后將重組質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化M.smegmatis表達(dá)，并通過(guò)Ni2+親和層析柱加以純化，對(duì)其特異性及其甲基化修飾進(jìn)行鑒定。
　　2、將純化好的mHBHA蛋白通過(guò)

3、體外IFN-γ酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)技術(shù)(enzyme-linkedimmunospot assay，ELISPOT)對(duì)86例ATB（其中菌陽(yáng)結(jié)核36例，菌陰結(jié)核50例）、15例LTBI、37例健康體檢者(healthy control，HC)的外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMC)進(jìn)行檢測(cè)，以ESAT-6/CFP-10/Rv3615c多肽庫(kù)作為對(duì)照抗原。
　　3、收集49例肺結(jié)核

4、(pulmonary tuberculosis，PTB)、21例肺外結(jié)核(extrapulmonary tuberculosis，EPTB)、16例LTBI、25例HC的血清，用mHBHA包被酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)板，檢測(cè)血清中mHBHA抗原特異性IgG、IgA抗體水平，以ESAT-6、Ag85A作為對(duì)照抗原。
　　結(jié)果:
　　1、成功構(gòu)建了pMFA

5、H41重組質(zhì)粒，表達(dá)并純化了mHBHA，其特異性與甲基化修飾鑒定正確。
　　2、基于mHBHA為基礎(chǔ)的ELISPOT檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)LTBI人群PBMCs分泌IFN-γ的T細(xì)胞頻數(shù)顯著高于ATB患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，且與病原檢出或結(jié)核感染方式無(wú)關(guān)，結(jié)果顯示無(wú)論是菌陽(yáng)結(jié)核與菌陰結(jié)核，亦或是PTB與EPTB，都與LTBI人群存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，而以ESAT-6/CFP-10/Rv3615c為對(duì)照抗原刺激時(shí)則沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P

6、＞0.05）。mHBHA檢測(cè)LTBI的受試者工曲線(receiver-operating characteristic，ROC)的曲線下面積(area under curve，AUC)為0.809(P＜0.0002)，準(zhǔn)確性較好，而對(duì)照抗原檢測(cè)LTBI的AUC僅為0.607(P＞0.05)。
　　3、抗mHBHA、ESAT-6、Ag85A抗原特異性IgG水平PTB組顯著高于HC組;mHBHA抗原特異性的IgA水平PTB組顯著高于H

7、C組(P＜0.05)，ESAT-6、Ag85A抗原特異性的IgA水平在兩組間卻無(wú)差異（P＞0.05）。ROC曲線分析mHBHA檢測(cè)PTB的AUC為0.703(P＜0.05)，ESAT-6檢測(cè)PTB的AUC為0.574（P＞0.05），Ag85A檢測(cè)PTB的AUC為0.560(P＞0.05)。
　　結(jié)論:
　　應(yīng)用mHBHA作為抗原建立的IFN-γELISPOT方法在鑒別診斷潛伏結(jié)核感染和活動(dòng)性結(jié)核方面具有潛在的應(yīng)用價(jià)值，尤其