特應(yīng)性皮炎的綜合高通量研究：通過OMICS手段探討疾病的核心蛋白與生物標(biāo)志物.pdf

1、目的和意義： 隨著現(xiàn)代化和工業(yè)化進程的加快，特應(yīng)性皮炎（AD）患病率增高，是皮膚病和公共衛(wèi)生領(lǐng)域的研究熱點。AD是一種慢性炎癥性皮膚病，易反復(fù)發(fā)作，以濕疹性皮損分布為特征。主要病理生理表現(xiàn)為苔蘚樣硬化、瘙癢性脫皮和皮膚干燥。AD是一種系統(tǒng)性功能失調(diào)性疾病，可同時觸發(fā)哮喘、過敏性鼻炎和食物過敏，伴有血漿IgE和嗜酸性粒細(xì)胞升高。因此，需要更深入的研究AD的發(fā)病機理，進一步闡明其免疫機制。 另外本研究還進行了分子水平的環(huán)境毒

2、理學(xué)研究。本研究以腦型肌酸激酶為模型，試圖探討小分子化合物對酶的結(jié)構(gòu)與功能影響。在了解CK-BB去折疊與再折疊過程基礎(chǔ)上，進一步對日常生活中人群接觸的頻率較高的十二烷基硫酸鈉（SDS）作用及與CK-BB結(jié)合機制進行了探討，而且闡述了兩種可能與退行性疾病相關(guān)的環(huán)境化學(xué)物，丙烯酰胺與鋅離子，對CK-BB的結(jié)構(gòu)與功能影響的作用機制。 研究方法： 1．本研究中對患者活檢樣本、原代細(xì)胞培養(yǎng)（角質(zhì)形成細(xì)胞和成纖維細(xì)胞）和血清樣本中的

3、基因改變進行研究。所有的AD樣本分為外源性（ADe）和內(nèi)源性（ADi）兩型。非特異性正常對照組（n=22），均無個人或家族史，過敏性疾病癥狀和體征，其樣本選自整形外科手術(shù)取下的皮膚。從ADe和ADi患者（n=40）皮損處取直徑3-5mm活檢樣本。20名ADe患者（SCORAD：50．09±15．68），20名ADi患者（SCORAD：46．38±11．77）。ADe組和ADi組總IgE水平、紅細(xì)胞計數(shù)和年齡的平均值分別為：1739 U/

4、mL，625/μL and27．4歲和105 U/mL，248/μL and28．2歲。所有樣本均取自于男性。血清按照之前報道的方法收集，等分試樣后儲藏在-80℃。 DNA芯片的制備按照RNA制備、標(biāo)記和雜交步驟進行：分別準(zhǔn)備正常對照、ADe、ADi樣本，每個樣本均進行cDNA模板合成和標(biāo)記。分別采用兩種芯片對不同樣本進行檢測：GeneChip（）人U133 Plus2．0芯片和GenePlorer Twinchip人-8K芯

5、片?；虮磉_比值經(jīng)過圖像分析，并用LOWESS回歸方程標(biāo)準(zhǔn)化。應(yīng)用SAM和DEG。選擇q值（按照5%）有明顯表達差異（>2倍）的基因。GeneChip（）人U133 Plus2．0芯片用來進行ADe和ADi皮膚組織的分析，而GenePlorer Twinchip人-8K芯片用于分析特應(yīng)性角質(zhì)形成細(xì)胞。自流電泳（FFE）和2-DE分別用于特應(yīng)性成纖維細(xì)胞和血清處理分析?；颊咴葱匝褰?jīng)多重親和移除柱（MARC）處理后進行2-DE分析。接下來

6、，用苯基瓊脂糖樹脂分段式方法進行AD血清蛋白質(zhì)的分析。血清經(jīng)柱子分離后TCA沉淀。 根據(jù)以上結(jié)果，可采組學(xué)工具來進行核心基因和蛋白質(zhì)的預(yù)測。PPI預(yù)測使用了PPI的主要算法，包括：1）蛋白結(jié)構(gòu)相互作用使用PSIMAP（蛋白質(zhì)組圖譜），一種使用SCOP（蛋白結(jié)構(gòu)分類）數(shù)據(jù)庫結(jié)構(gòu)域的方法；2）蛋白質(zhì)實驗性相互作用PEIMAP（蛋白質(zhì)組圖譜），是一種普遍的使用實驗性蛋白相互反應(yīng)信息資源的方法，如HPRD、BIND、DIP、MINT、I

7、ntAct和BioGid。 2．重組人CK-BB按照之前報道的方法進行表達和純化。CK-BB活性測定采用ATP和肌酸反應(yīng)釋放質(zhì)子，在百里酚藍指示劑存在下，其597nm光吸收變化速率對應(yīng)于酶活性。內(nèi)源熒光和ANS結(jié)合光譜方法檢測CK-BB三級結(jié)構(gòu)的影響。采用圓二色譜分光光度計，在190-250nm范圍內(nèi)記錄遠(yuǎn)紫外圓二色譜（CD）光譜檢測CK-BB二級結(jié)構(gòu)的影響。等溫滴定微量量熱法采用3101TAMⅢ恒溫箱按照之前報道的方法進行測量

8、。從蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫（PDB）中獲得已知的CK-BB同源性結(jié)構(gòu)。發(fā)現(xiàn)同系物牛的視黃醛肌酸激酶A鏈（PDB編碼：1g0w）是一個良好的CK-BB結(jié)構(gòu)模板（含97%相同序列）。結(jié)合模擬操作分為：1）計算相應(yīng)的受體和3D配體，2）對接大小特征，3）計算網(wǎng)格評分，4）決定補充受體和配體對接。 結(jié)果 1．Affymetrix芯片檢測出406種差異表達基因（DEG），在正常人和AD患者（ADe和ADi）之間，鑒別出130個DEG；在正常

9、人和ADe患者之間，鑒別出327個DEG；在正常人和ADi患者之間，鑒別出146個DEG。8K cDNA芯片結(jié)果顯示在原代培養(yǎng)的角質(zhì)形成細(xì)胞AD疾病中有157個基因失調(diào)。接下來，通過FFE在AD成纖維細(xì)胞中獲得93個候選基因。MARC處理后的AD血清樣本檢測到30個上調(diào)蛋白質(zhì)和19個下調(diào)蛋白質(zhì)。改進分段方法，檢測到9個失調(diào)基因。Affymetrix芯片分析利用PSIMAP和PEIMAP兩種不同的生物信息學(xué)計算方法得到5個和8個核心基因，

10、分別是：PIK3R1、IGFIR、MAPK13、SFN、YWHAE和CORIN、COL14A1、CLCA4、PTPRC、IL10RA、CIS、PHLPP、SLITRK6。應(yīng)用8K cDNA芯片在角質(zhì)形成細(xì)胞中找出25個基因。通過FFE在AD成纖維細(xì)胞中4個核心蛋白在PSIMAP和PEIMAP算法中均檢測到，即：I55423、ARR3、YWHAE和EEF1A1。AD血清樣本的2-DE結(jié)果中發(fā)現(xiàn)26種蛋白質(zhì)。AD組織中SFN和PTPRC經(jīng)實

11、時PCR進一步驗證。結(jié)果發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄水平的SFN在ADi中上調(diào)4．5倍，PTPRC在ADe和ADi中分別下調(diào)60%和46%。ELISA結(jié)果顯示，MMP1和MMP10在ADi患者中均上調(diào)。ADi患者血清的ELISA研究結(jié)果表明，與正常人和ADe患者相比較，MMP1和MMP10顯著上調(diào)（幾乎兩倍），均存在統(tǒng)計學(xué)差異，采用隨機配對和Wilcoxon檢測。 2．對SDS使CK-BB的折疊后的失活進行了研究。SDS能非競爭性抑制CK-BB的活

12、性（Ki=1．22 mM）。SDS與CK-BB暴露的疏水表面結(jié)合誘導(dǎo)其三級結(jié)構(gòu)的改變。SDS配體結(jié)合熱力學(xué)參數(shù)的改變?nèi)珈省⒓妓棺杂赡芎挽胤謩e為-13±7．0MJ/mol，8．39 kJ/mol and-42．754 kJ/（K·mol）。研究明確了重要的CK-BB結(jié)構(gòu)以及和SDS相互反應(yīng)的折疊和抑制動力學(xué)信息。預(yù)測的結(jié)構(gòu)具有0．51 A的均方根偏差。CK-BB與SDS之間對接成功，具有顯著性評分（-4．67 kcal/mol，自動對接

13、4和-48．32 kcal/mol，DOCK6）。丙烯酰胺對腦型肌酸激酶（CK-BB）的抑制效應(yīng)研究發(fā)現(xiàn)，CK-BB能被動態(tài)的失活并伴隨疏水表面的暴露。丙烯酰胺主要與CK-BB的硫氫基（-SH）殘基相互作用導(dǎo)致烷化。計算機模擬對接支持丙烯酰胺直接結(jié)合到CK-BB的活性位點上，主要與CYS74和GLY73殘基相互作用。Zn2+通過劑量依賴效應(yīng)失活CK-BB（IC50=0．06 mM）。Zn2+顯著誘導(dǎo)CK-BB疏水基表面破裂導(dǎo)致三維結(jié)構(gòu)改

14、變。還發(fā)現(xiàn)Zn2+能使CK-BB發(fā)生聚沉。聚沉依賴于溫度以及酶和Zn2+的濃度。 結(jié)論 1．為了更深入了解AD發(fā)病機制，明確在AD病情發(fā)展中有多少基因起作用，進行了大規(guī)模的微陣列研究，得到許多新的相關(guān)信息。結(jié)果主要集中在AD相關(guān)基因大規(guī)模DNA芯片研究的描述上，這將為全面了解AD疾病提供新的見解，但是結(jié)果中尚不包括詳細(xì)的功能研究。在后續(xù)的實驗中進行了AD皮膚組織的研究并檢測到了核心基因。然后進行角質(zhì)形成細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的

15、研究。同時還對AD患者血清中蛋白質(zhì)差異表達進行了研究。已知多種因子參與了AD的發(fā)病，不同的患者中存在多種觸發(fā)因素，本研究數(shù)據(jù)提示人表皮角質(zhì)形成細(xì)胞和真皮成纖維細(xì)胞活化在AD疾病中起作用。然而，在原代培養(yǎng)的角質(zhì)形成細(xì)胞和成纖維細(xì)胞中檢測到的蛋白質(zhì)或基因可能提示著體內(nèi)也存在相應(yīng)的蛋白質(zhì)變化，但是mRNA水平和表達的蛋白質(zhì)水平之間的差異干擾了對AD中準(zhǔn)確作用的理解。 大規(guī)模的芯片研究結(jié)果能有助于深入了解AD發(fā)病機制的復(fù)雜的相關(guān)因素。結(jié)

16、合表達數(shù)據(jù)分析和蛋白質(zhì)相互作用組預(yù)測能找到更可靠的與AD疾病相關(guān)的基因。預(yù)測的蛋白質(zhì)相互作用配體和核心蛋白能為下一步AD治療的功能研究提供有效、可靠的靶點。AD患者數(shù)量迅速增多，急需找到特異性診斷和敏感性治療方法。因此，OMICS手段的應(yīng)用改善了對AD皮膚組織的表達形式以及組分如角質(zhì)形成細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的研究。根據(jù)本研究，得出以下結(jié)論：1）生物信息學(xué)工具結(jié)合HTS數(shù)據(jù)篩選新的核心基因或蛋白，在今后的功能學(xué)研究和臨床藥物開發(fā)中將發(fā)揮重要作

17、用；2）本研究中發(fā)現(xiàn)多個在AD源性樣本中表達顯著改變的重要基因，如SFN、PTPRC、MMP1和MMP10，可能是AD疾病的生物學(xué)標(biāo)記；3）本研究中預(yù)測出的大部分核心蛋白、以及實時PCR檢測出的候選基因/蛋白在之前關(guān)于AD發(fā)病機制的研究中未見報道；4）結(jié)合基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)和相互作用組分析方法等研究手段將有助于AD復(fù)雜病理機制的研究，以及準(zhǔn)確的生物標(biāo)記物或臨床治療靶點的探測。 2．本部分研究我們以腦型肌酸激酶（CK-BB）為模

18、型，探討了小分子工業(yè)化學(xué)物通過影響酶的結(jié)構(gòu)和功能，引發(fā)蛋白質(zhì)錯去折疊，導(dǎo)致酶的失活以及聚沉的毒理途徑。不管是SDS（兩親變性劑），丙烯酰胺（巰基加合物），還是Zn2+（金屬離子），都可以誘導(dǎo)蛋白質(zhì)疏水表面的暴露。尤其是Zn2+促發(fā)CK-BB發(fā)生聚沉。這種由小分子化學(xué)物誘發(fā)的聚沉現(xiàn)象在許多退行性病變中可能具有重要的意義，其確切的病理價值有待進一步深入研究。環(huán)境中存在大量的具有慢性神經(jīng)毒作用的工業(yè)化學(xué)品。這些小分子化學(xué)物是否具有協(xié)同作用，誘