高通量芯片篩選肝細(xì)胞肝癌拷貝數(shù)變異及相關(guān)基因的研究.pdf

1、第一部分、高通量單核苷酸芯片篩選肝細(xì)胞肝癌拷貝數(shù)變異及相關(guān)基因
　　 目的：探討全基因組拷貝數(shù)變異(Copy number variation，CNV)在肝細(xì)胞肝癌(Hepatocellular carcmoma，HCC)患者中的變化情況以及與HCC的關(guān)系。
　　 方法：1、用Affymetrix500K SNP(Single nucleotide polymorphism，單核苷酸多態(tài)性)芯片檢測50例試驗組(乙型病毒

2、性肝炎(Heptesis B virsus，HBV)陽性HCC患者)和50例對照組(乙型病毒性肝炎陽性無HCC對照人群)中的CNV；2、在檢測出的HCC可能相關(guān)的CNV中，隨機(jī)挑選5個CNV，用實時定量PCR(SYBRGreen real-time Polymerase Chain Reaction，RT-PCR)在282例試驗組(乙型病毒性肝炎陽性HCC患者)和278例對照組(乙型病毒性肝炎陽性無HCC對照人群)中驗證芯片篩選結(jié)果。<

3、br>　　 結(jié)果：1、檢測到HCC可能相關(guān)的拷貝數(shù)變異區(qū)域(CNV regions)共有13個，其中10個為拷貝數(shù)擴(kuò)增，3個為拷貝數(shù)缺失。2、經(jīng)與DGVs數(shù)據(jù)庫和UCSC數(shù)據(jù)庫比對，13個拷貝數(shù)變異區(qū)域中，6個與DGVs數(shù)據(jù)庫報道的存在于正常人群的CNV區(qū)域重疊；2個與UCSC數(shù)據(jù)庫報道的在一些遺傳病中出現(xiàn)的CNV區(qū)域一致；1個共存于DGVs數(shù)據(jù)庫和UCSC數(shù)據(jù)庫中；4個為新發(fā)現(xiàn)的CNV區(qū)域(2q14.3，6q16.1，8q23.2，

4、17q22的擴(kuò)增)。3、發(fā)生率較高的為2個擴(kuò)增區(qū)域：2號染色體2p12(64％)和5號染色體5q34(60％)，以及一個缺失區(qū)域：15號染色體15q23(62％)。4、隨機(jī)挑選5個CNV區(qū)域(2q14.3，5q34，8q23.2，7q11.23，17q25.3)，經(jīng)實時定量PCR檢測證實與芯片結(jié)果一致。5、共檢測到CNV相關(guān)的HCC可能相關(guān)基因有14個，其中5個基因首次在肝細(xì)胞肝癌中報道。
　　 結(jié)論：肝細(xì)胞肝癌患者中存在CNV

5、，且可能與HCC的發(fā)生有重要關(guān)系，并有可能成為遺傳易感標(biāo)志，同時有助于尋找HCC的相關(guān)基因。
　　 第二部分、肝細(xì)胞肝癌可能相關(guān)基因相互關(guān)系及功能分類的網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建
　　 目的：探討肝細(xì)胞肝癌可能相關(guān)基因的相互關(guān)系及功能分類。
　　 方法：用GO、MAS3.0、DAVID和STRING服務(wù)器在線分析檢測到的14個CNV相關(guān)的HCC可能相關(guān)基因，挖掘這些基因可能參與的信號通路，相互作用方式，功能分類與蛋白網(wǎng)絡(luò)，預(yù)測其在

6、肝細(xì)胞肝癌中可能的作用方式和通路。
　　 結(jié)果：14個CNV相關(guān)的HCC可能相關(guān)基因主要涉及蛋白磷酸化，質(zhì)膜構(gòu)成，序列變異，可變剪接，轉(zhuǎn)錄，剪接變異，質(zhì)膜，胞外區(qū)，誘變位點，疾病基因突變，胞膜構(gòu)成，有轉(zhuǎn)錄本調(diào)節(jié)活性，二硫鍵，信號，信號肽，多態(tài)性，剪接變異體，糖蛋白。STRING分析發(fā)現(xiàn)這14個CNV相關(guān)的HCC可能相關(guān)基因網(wǎng)絡(luò)中有兩個重要節(jié)點：GABRG2和KIF2B，且均和癌癥有關(guān)。
　　 結(jié)論：14個CNV相關(guān)的HC

7、C可能相關(guān)基因在HCC的發(fā)生、發(fā)展中可能起重要作用。
　　 第三部分、NOVA1基因和拷貝數(shù)變異區(qū)域14q12以及肝細(xì)胞肝癌關(guān)系的研究
　　 目的：探討拷貝數(shù)變異區(qū)域14q12與相關(guān)基因NOVA1(Neuro-oncological ventralantigen1，腫瘤神經(jīng)腹側(cè)抗原)之間的關(guān)系，以及兩者與HCC之間的相互關(guān)系。
　　 方法：1、實時定量PCR4(SYBR Green real-time PCR，R

8、T-PCR)檢測282例試驗組(HBV陽性HCC患者)和278例對照組(HBV陽性無HCC對照人群)外周血中14q12拷貝數(shù)變異，擴(kuò)大樣本以驗證14q12拷貝數(shù)變異與HCC的關(guān)系；2、免疫組化檢測120例乙肝陽性HCC患者的肝癌組織、癌旁組織中14q12拷貝數(shù)變異區(qū)域相關(guān)基因NOVA1的蛋白表達(dá)水平，以了解NOVA1基因與HCC的關(guān)系。3、取40例HBV陽性HCC患者的肝癌組織，免疫組化檢測NOVA1蛋白的表達(dá)，同時RT-PCR檢測14

9、q12的拷貝數(shù)變異情況，以了解NOVA1基因與14q12的拷貝數(shù)變異之間的關(guān)系。
　　 結(jié)果：1、RT-PCR結(jié)果示14q12拷貝數(shù)變異區(qū)域在282例試驗組中拷貝數(shù)增高，與對照組相比差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。2、免疫組化結(jié)果示NOVA1蛋白在肝細(xì)胞肝癌組織中表達(dá)明顯高于癌旁組織，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。3、在40例HBV陽性HCC患者的肝癌組織中同時檢測14q12拷貝數(shù)變異及NOVA1蛋白表達(dá)，結(jié)果顯示14q12拷貝數(shù)擴(kuò)增的患者其肝癌組織

10、中NOVA1蛋白亦呈高表達(dá)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 結(jié)論：1、14q12拷貝數(shù)擴(kuò)增是HCC相關(guān)的拷貝數(shù)變異區(qū)域；2、NOVA1基因為14q12拷貝數(shù)變異區(qū)域的相關(guān)基因；3、NOVA1基因是肝細(xì)胞肝癌相關(guān)基因，在肝細(xì)胞肝癌的發(fā)生中可能起重要作用。
　　 第四部分、NOVA1基因過表達(dá)對肝癌細(xì)胞生長增殖的影響
　　 目的：檢測NOVA1基因過表達(dá)對肝癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響。
　　 方法：1、使用逆轉(zhuǎn)錄PC

11、R(Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction，RT=PCR)法檢測(SMMC-7721，HepG2，MHCC97H，MHCC97L，SK-HepG1，PLC/PRF/5)6株肝細(xì)胞肝癌細(xì)胞株及1株正常肝細(xì)胞株ATCC L-O2中NOVA1基因的表達(dá)，以篩選出低表達(dá)NOVA1的細(xì)胞株；2、構(gòu)建NOVA1基因過表達(dá)質(zhì)粒，并轉(zhuǎn)染低表達(dá)NOVA1基因的細(xì)胞株；3、MTT法檢測經(jīng)轉(zhuǎn)染后肝癌細(xì)胞

12、的生長曲線；4、流式細(xì)胞儀檢測經(jīng)轉(zhuǎn)染后肝癌細(xì)胞的細(xì)胞凋亡。
　　 結(jié)果：1、SMMC-7721細(xì)胞株和MHCC97L細(xì)胞株為低表達(dá)NOVA1基因的肝癌細(xì)胞株；2、MTT法檢測結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染了過表達(dá)NOVA1基因質(zhì)粒的SMMC-7721細(xì)胞和MHCC97L細(xì)胞與未轉(zhuǎn)染的SMMC-7721細(xì)胞和MHCC97L細(xì)胞比較，生長增殖能力明顯增強(qiáng)：3、流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染了過表達(dá)NOVA1基因質(zhì)粒的SMMC-7721細(xì)胞和MHCC97L

13、細(xì)胞的早期凋亡和晚期凋亡均明顯減弱。
　　 結(jié)論：NOVA1基因可促進(jìn)肝癌細(xì)胞的生長增殖、抑制凋亡，是肝細(xì)胞肝癌相關(guān)基因，對肝細(xì)胞肝癌的發(fā)生可能有重要意義。
　　 第五部分、NOVA1基因干擾對肝癌細(xì)胞生長增殖的影響
　　 目的：檢測NOVA1基因干擾對肝癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響。
　　 方法：1、使用逆轉(zhuǎn)錄PCR(Reverse Transcription-Polymerase Chain Reactio

14、n，RT-PCR)法檢測(SMMC-7721，HepG2，MHCC97H，MHCC97L，SK-HepG1，PLC/PRF/5)6株肝細(xì)胞肝癌細(xì)胞株及1株正常肝細(xì)胞株ATCC L-O2中NOVA1基因的表達(dá)，以篩選出高表達(dá)NOVA1的肝癌細(xì)胞株；2、構(gòu)建NOVA1基因干擾質(zhì)粒，并轉(zhuǎn)染高表達(dá)NOVA1基因的HepG2細(xì)胞株和MHCC97H細(xì)胞株；3、MTT法檢測經(jīng)轉(zhuǎn)染后肝癌細(xì)胞的生長增殖；4、流式細(xì)胞儀檢測經(jīng)轉(zhuǎn)染后肝癌細(xì)胞的細(xì)胞凋亡；5、

15、劃痕實驗檢測經(jīng)轉(zhuǎn)染后肝癌細(xì)胞的細(xì)胞遷移能力。
　　 結(jié)果：1、HepG2細(xì)胞株和MHCC97H細(xì)胞株為高表達(dá)NOVA1的肝癌細(xì)胞株；2、MTT法檢測結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染了NOVA1基因干擾質(zhì)粒的HepG2細(xì)胞和MHCC97H細(xì)胞生長增殖能力明顯減弱；2、流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染了NOVA1基因干擾質(zhì)粒的肝癌細(xì)胞的凋亡更為明顯。3、細(xì)胞劃痕實驗結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染了NOVA1基因干擾質(zhì)粒的肝癌細(xì)胞遷移能力明顯減弱。
　　 結(jié)論：NOVA