Noonan綜合征相關(guān)基因突變和拷貝數(shù)變異研究.pdf

1、第一章18例Noonan綜合征患者的基因突變研究
　　 目的:探索PTPN11、SOS1、KRAS及RAF1四個主要Noonan綜合征致病基因在中國Noonan綜合征患者中的致病頻率及發(fā)現(xiàn)新突變。
　　 研究對象:根據(jù)臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)，于2009年1月至今收集就診于中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院小兒心臟外科的Noonan綜合征患兒18例。其中男性11例，女性7例。
　　 方法:抽取17例患兒及其可獲得的父母親外周靜脈血進(jìn)行G顯帶

2、染色技術(shù)，排除21三體、18三體及Turner綜合征等染色體病(5號病例已于外院行G顯帶染色技術(shù)檢測)。再利用美國QIAGEN公司gDNA抽提試劑盒，按照其標(biāo)準(zhǔn)抽提流程對排除染色體病后的患兒及其可獲得的父母親外周靜脈血進(jìn)行g(shù)DNA抽提。然后對PTPN11、SOS1、KRAS及RAF1分別設(shè)計相應(yīng)的引物進(jìn)行擴(kuò)增，利用ABI公司BigDye Terminator v1.1測序試劑盒及其3100測序儀對其PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測序分析。
　

3、　 結(jié)果:通過G顯帶技術(shù)我們在18例Noonan綜合征患兒中發(fā)現(xiàn)5號病例染色體結(jié)構(gòu)異常:46，XX，dup(12)(q22→q23)（該患者進(jìn)入第二章SNP array芯片技術(shù)進(jìn)一步分析）。17例患者進(jìn)入突變檢測，有3例發(fā)現(xiàn)PTPN11的錯義突變:病例1:p.D61N，c.181G＞A;病例3:p.3N308S, c.923A＞G;病例9:p.M203I, c.606G＞A突變。以上3種突變都未收錄于the Single Nucleo

4、tide Polymor Polymorphism數(shù)據(jù)庫(dbSNP)中。 D61N及N308S為已報道過的突變，M203I尚未有報道，為新突變。我們在對患兒的父母親及100個正常人進(jìn)行檢測未發(fā)現(xiàn)上述突變。
　　 結(jié)論:1）PTPN11為Noonan綜合征的主要致病基因;2)染色體結(jié)構(gòu)異常可能是Noonan綜合征致病原因之一。
　　 第二章15例Noonan綜合征患者的拷貝數(shù)變異研究
　　 目的:探討Noonan

5、綜合征相關(guān)拷貝數(shù)變異，尋找與該疾病相關(guān)的核心基因。
　　 研究對象:第一章中G顯帶技術(shù)發(fā)現(xiàn)染色體結(jié)構(gòu)異常的5號病例及經(jīng)過PTPN11、SOS1、KRAS及RAF1四個基因突變篩選后的14例Noonan綜合征患者，共15例患者。
　　 方法:利用美國illumina公司生產(chǎn)的Human660W-Quad及HumanOmni1-quad芯片，采用高通量SNParray芯片技術(shù)對15例患者的gDNA進(jìn)行CNVs檢測。并設(shè)計致病

6、CNVs中核心基因的引物，利用美國Applied Biosystems公司生產(chǎn)的ABI Step one定量PCR儀，對相應(yīng)病例的gDNA樣本實(shí)行SYBR(R) GreenⅠ嵌合熒光法Real-TimePCR，并利用Applied Biosystems的StepOne Software v2.1軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析驗(yàn)證芯片結(jié)果。
　　 結(jié)果:我們發(fā)現(xiàn)兩例包含核心基因的染色體區(qū)間重復(fù):病例5的大小為24Mb包含PTPN11基因的12q

7、24.1-12q24.3重復(fù);病例16的大小0.25Mb包含RAF1基因的3p25.2微重復(fù)。我們對PTPN111及RAF1關(guān)鍵基因進(jìn)行Real-time PCR，其結(jié)果發(fā)現(xiàn)這2個致病性CNVs中的關(guān)鍵基因拷貝數(shù)約為正常對照組的1.4-1.5倍，說明其拷貝量增加，與芯片結(jié)果一致。
　　 結(jié)論:1）拷貝數(shù)變異也是Noonan綜合征的致病原因之一，并已明確PTPN11及RAF1的重復(fù)可以導(dǎo)致Noonan綜合征;2)SNP array