GPCR信號(hào)通路研究模型的建立與應(yīng)用及孤兒受體的藥物篩選.pdf

1、G蛋白偶聯(lián)受體（G protein-coupled receptors, GPCRs）主要通過激活G蛋白調(diào)節(jié)下游信號(hào)，從而參與某些生理病理反應(yīng)，而β-arrestin作為細(xì)胞內(nèi)的一種重要骨架蛋白，在絕大部分GPCR介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中具有重要調(diào)節(jié)作用，調(diào)控GPCR脫敏、內(nèi)吞、細(xì)胞增殖和基因轉(zhuǎn)錄，因此通過研究GPCR與β-arrestin的相互作用來研究GPCR介導(dǎo)的β-arrestin信號(hào)通路顯得非常必要。本文通過構(gòu)建叩頭蟲熒光素酶（Bra

2、zilian Cratomorphus distinctus;Emerald Luc;ELuc）片段分別與AGTR1(β2AR, GCGR)和β-arrestin1/2融合表達(dá)質(zhì)粒，其N端（1-415 aa）與β-arrestin1/2 N端融合（ELucN-β-arrestin1/2），C端（394-542 aa）與AGTR1(β2AR, GCGR) C端融合（AGTR1/β2AR/GCGR-ELucC），瞬轉(zhuǎn)至HEK293細(xì)胞中，分

3、別采用Western blot、免疫熒光染色及鈣流實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證融合表達(dá)質(zhì)粒在HEK293細(xì)胞中的表達(dá)及其生物學(xué)活性，然后共轉(zhuǎn) AGTR1/β2AR/GCGR-ELucC和ELucN-β-arrestin1/2至HEK293細(xì)胞中，通過對(duì)細(xì)胞轉(zhuǎn)染條件的優(yōu)化以及化合物刺激時(shí)間的研究，檢測(cè)在配體刺激下AGTR1(β2AR, GCGR)與β-arrestin1/2相互作用情況，并利用該檢測(cè)模型對(duì)已報(bào)道的AGTR1、β2AR的偏向性激動(dòng)劑進(jìn)行驗(yàn)證。

4、研究發(fā)現(xiàn)，在該模型檢測(cè)下Angiotensin-2、Isoproterenol分別能夠劑量依賴性的引起AGTR1、β2AR與β-arrestin1/2相互作用的改變，同時(shí)對(duì)于偏向性激動(dòng)劑的驗(yàn)證中，只有 Angiotensin-2能激活 AGTR1介導(dǎo)的 Gq信號(hào)通路，而Angiotensin-2、S-2、TRV120023均能劑量依賴性增強(qiáng)AGTR1與β-arrestin1/2相互作用，Isoetharine、Ethylnorepine

5、phrine在激活β2AR時(shí)更偏向于β-arrestin1/2信號(hào)通路，這些結(jié)果均與文獻(xiàn)報(bào)道相符，表明我們成功地構(gòu)建了AGTR1、β2AR與β-arrestin1/2相互作用檢測(cè)模型，而且該模型可靠、準(zhǔn)確，為GPCR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路及其偏向性激動(dòng)劑研究奠定了良好的基礎(chǔ)。
　　此外，我們按照相同的方式利用ELuc片段互補(bǔ)分析建立了β2AR與G蛋白相互作用檢測(cè)模型，研究了β2AR與Gα16相互作用情況，并結(jié)合免疫共沉淀的結(jié)果，我們得知在β