抗氧化藥物篩選細(xì)胞模型的建立與應(yīng)用.pdf

1、眾多疾病的發(fā)生、發(fā)展與機(jī)體氧化應(yīng)激密切相關(guān)，如衰老、糖尿病、心血管疾病等。為尋找高效、低毒的抗氧化藥物，建立快速有效的篩選方法和篩選模型具有重要意義。本文旨在建立一種高效、簡(jiǎn)便、高度敏感的高通量篩選抗氧化藥物的細(xì)胞模型，并應(yīng)用于抗氧化候選藥物的初步篩選。Keapl-Nrf2-ARE信號(hào)通路調(diào)節(jié)機(jī)體內(nèi)多種抗氧化酶和II相解毒酶的表達(dá)，在氧化應(yīng)激反應(yīng)中起著重要作用。本研究利用抗氧化反應(yīng)元件ARE調(diào)控?zé)晒馑孛笀?bào)告基因的表達(dá)水平,建立抗氧化藥物

2、篩選細(xì)胞模型。
　　 構(gòu)建由ARE調(diào)控?zé)晒馑孛笀?bào)告基因表達(dá)的重組質(zhì)粒載體pARE-Luc-Neo。采用MTT法評(píng)價(jià)G418對(duì)Hek293的毒性作用，確定G418最佳篩選濃度為800μg/mL。使用FuGENE(R)HD轉(zhuǎn)染試劑將pARE-Luc-Neo轉(zhuǎn)染Hek293細(xì)胞（人胚腎上皮細(xì)胞）。轉(zhuǎn)染24h后，通過(guò)G418篩選，稀釋法挑選陽(yáng)性單克隆細(xì)胞株，獲得26株單克隆細(xì)胞株。單克隆細(xì)胞株經(jīng)Ⅱ相解毒酶誘導(dǎo)劑TBHQ誘導(dǎo)篩選，檢測(cè)細(xì)胞

3、中熒光素酶的活性，獲得熒光素酶高表達(dá)細(xì)胞株Hek293-ARE。利用TBHQ、白藜蘆醇、姜黃素和穿心蓮內(nèi)酯評(píng)價(jià)Hek293-ARE的篩選效果，結(jié)果表明TBHQ、白藜蘆醇、姜黃素和穿心蓮內(nèi)酯對(duì)Hek293-ARE細(xì)胞中熒光素酶的表達(dá)具有良好的誘導(dǎo)效果，且在一定范圍內(nèi)與誘導(dǎo)劑濃度呈劑量效應(yīng)關(guān)系。從遺傳穩(wěn)定性和表達(dá)穩(wěn)定性兩方面驗(yàn)證細(xì)胞模型的穩(wěn)定性，結(jié)果表明細(xì)胞模型穩(wěn)定性良好，經(jīng)過(guò)以上驗(yàn)證表明成功建立了抗氧化藥物細(xì)胞篩選模型，Hek293-AR

4、E細(xì)胞可用于抗氧化物的初步篩選.
　　 將細(xì)胞模型應(yīng)用于對(duì)現(xiàn)有的18種中藥單體的篩選，結(jié)果表明中藥單體熊果酸、隱丹參酮、黃連素、水飛薊素、芹菜素、染料木素、燈盞花素、黃芩苷、大豆苷元、漢黃芩素、大黃素和大黃酸對(duì)Hek293-ARE細(xì)胞中熒光素酶的表達(dá)有良好的誘導(dǎo)效果，并在一定范圍內(nèi)具有明顯的劑量效應(yīng)關(guān)系，提示這12種中藥單體可能通過(guò)激活Keap1-Nrf2-ARE信號(hào)通路發(fā)揮其抗炎、抗氧化等作用。對(duì)蛹蟲(chóng)草粗多糖的篩選結(jié)果表明，蛹

5、蟲(chóng)草粗多糖對(duì)Hek293-ARE細(xì)胞中熒光素酶的表達(dá)有良好的誘導(dǎo)效果，并在一定范圍內(nèi)具有明顯的效應(yīng)劑量關(guān)系，提示蛹蟲(chóng)草粗多糖能夠誘導(dǎo)抗氧化酶和Ⅱ相解毒酶的表達(dá)而起到抗氧化的作用。對(duì)蛹蟲(chóng)草水提組分的篩選結(jié)果表明，2＃、3＃、4＃、7＃、11＃、12＃和14＃樣品對(duì)Hek293-ARE細(xì)胞中熒光素酶的表達(dá)有良好的誘導(dǎo)效果，提示這些組分可激活Keap1-Nrf2-ARE信號(hào)通路，從而可能具有抗氧化的作用。
　　 抗氧化藥物篩選細(xì)胞模型