脂肪肝體內(nèi)外模型的建立及藥物篩選.pdf

1、目的：脂肪肝是代謝綜合癥的表現(xiàn)，早期表現(xiàn)為單純性脂肪變性，其后可能還會(huì)發(fā)生脂肪性肝炎，肝纖維化，肝硬化。它的高發(fā)病率越來越受到重視。積極研究開發(fā)治療脂肪肝的高效、價(jià)廉、方便、安全的藥物意義重大。本課題探討建立脂肪肝體外模型和動(dòng)物模型，觀察姜黃素衍生物JZ2、SFR1和四氫姜黃素對(duì)體內(nèi)外脂肪肝模型的保護(hù)作用。
　　 方法：(1)采用油酸作用于肝癌細(xì)胞HepG2和人正常肝細(xì)胞株L02的方法在體外建立脂肪肝細(xì)胞模型，并應(yīng)用MTT法篩選

2、姜黃素衍生物JZ2、SFR1及四氫姜黃素作用于肝細(xì)胞的非細(xì)胞毒濃濃度，以油紅0染色，觀察不同給藥組非細(xì)胞毒濃度對(duì)細(xì)胞內(nèi)脂滴形成情況，并檢測細(xì)胞上清液的ALT、AST及γ-GT。從而觀察藥物在體外抗脂肪肝的作用效果。(2)通過給予高脂飼料、腹腔注射四環(huán)素的復(fù)合方式建立小鼠脂肪肝的模型，同時(shí)給予不同劑量的姜黃素衍生物JZ2、SFR1和四氫姜黃素固體分散劑，于實(shí)驗(yàn)第36天，取血及肝組織，計(jì)算肝指數(shù)、檢測血脂及肝功：血清TG、CHO、LDL-C

3、、HDL-C、ALT、AST，肝臟內(nèi)脂質(zhì)：肝勻漿TG、CHO；采用肝臟冰凍切片及油紅0染色、病理切片等手段觀察肝臟的病理變化。從而觀察藥物在小鼠體內(nèi)抗脂肪肝的療效。
　　 結(jié)果：⑴通過MTT法篩選出姜黃素衍生物JZ2、SFR1的非細(xì)胞作用濃度為100ug/ml、200 ug/m1、300 ug/ml、400 ug/ml，四氫姜黃素的非細(xì)胞作用濃度為10 ug/ml、20 ug/ml、30 ug/ml；⑵油紅0染色后，在光鏡下觀察

4、發(fā)現(xiàn)80 ug/ml油酸刺激HepG2細(xì)胞24小時(shí)后，模型組細(xì)胞內(nèi)有大量的紅色脂滴積聚，48小時(shí)后紅色脂滴開始減少；60 ug/ml油酸刺激L02細(xì)胞24小時(shí)后，模型組細(xì)胞內(nèi)有大量的紅色脂滴積聚，72小時(shí)后細(xì)胞紅色脂滴開始減少。間隔24小時(shí)兩次給藥，藥物作用于HepG2細(xì)胞48、72小時(shí)均未見脂滴減少;藥物作用于L02細(xì)胞48小時(shí)未見脂滴減少；藥物作用于L02細(xì)胞72小時(shí)隨著作用濃度的增加細(xì)胞內(nèi)的脂滴逐漸減少。⑶用ImagePro Pl

5、us6.0圖像分析軟件分析藥物對(duì)油酸刺激48h后L02細(xì)胞的油紅0染色圖片，各給藥組與模型組比較，脂滴顯著減少(P＜0.05)。其中四氫姜黃素30ug/ml，JZ2300ug/ml，SFR1400ug/ml差異有極顯著性區(qū)別(P＜0.01)。⑷檢測細(xì)胞上清液中ALT、AST、γ-GT，表明四氫姜黃素對(duì)肝功能影響較小，JZ2、SFR1對(duì)肝功能均有一定影響。⑸通過給予高脂飼料、腹腔注射150mg/kg四環(huán)素的復(fù)合方式成功建立了小鼠脂肪肝的模

6、型，與正常組相比，模型組小鼠的肝指數(shù)、血清TG、CHO、LDL-C、ALT、AST以及肝勻漿TG、CHO均顯著升高(P＜0.05)。肝臟冰凍切片油紅0染色、肝臟病理切片及HE染色也證實(shí)其發(fā)生了脂肪肝病變；⑹與模型組相比，四氫姜黃素固體分散劑對(duì)CHO、LDL-C、HDL-C有降低趨勢，但在低劑量組作用更顯著，部分?jǐn)?shù)據(jù)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，對(duì)TG作用不明顯。在肝指數(shù)、肝內(nèi)脂質(zhì)特別是TG、肝功ALT、AST方面都有下降作用，且有明顯的劑量依賴關(guān)系。2

7、00mg/kg組、300mg/kg組對(duì)肝指數(shù)、肝內(nèi)脂質(zhì)(TG)、肝功ALT的改善具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。冰凍切片油紅0染色及病理切片也證明四氫姜黃素對(duì)小鼠脂肪肝的保護(hù)作用。⑺與模型組比較，姜黃素衍生物JZ2在高、低劑量組對(duì)血脂TG、CHO、LDL-C有不同程度的降低，部分?jǐn)?shù)據(jù)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義， TG、HDL-C在低劑量組作用更好。SFR1高低劑量對(duì)血脂CHO、LDL-C不同程度的降低，部分?jǐn)?shù)據(jù)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但對(duì)TG影響不理想。兩藥對(duì)小鼠的肝指數(shù)、肝

8、臟內(nèi)脂質(zhì)無明顯作用。冰凍切片油紅0染色及病理切片與模型組比較沒有明顯區(qū)別。
　　 結(jié)論：(1)建立了較穩(wěn)定的脂肪肝體外篩藥模型：油酸刺激L02細(xì)胞48小時(shí)，在油酸刺激前24小時(shí)藥物給藥一次，24小時(shí)后與油酸一起再給藥一次，可以篩選出藥物的體外抗脂肪肝作用。(2)建立了小鼠脂肪肝模型：高脂飼料、腹腔注射150mg/kg四環(huán)素。(3)姜黃素衍生物JZ2、SFR1與四氫姜黃素均具有一定干預(yù)脂肪肝體外模型的作用，有效減少細(xì)胞內(nèi)脂滴的形成