脂肪肝的實驗研究

1、1,脂肪肝的實驗研究,生理學與病理生理學系 林 岷,2,概述脂肪肝的病因脂肪肝的發(fā)病機制脂肪肝實驗模型的建立方法脂肪肝的診斷脂肪肝的防治,3,概 述,,4,脂肪肝是僅次于病毒性肝炎的第二位常見肝病，是二十一世紀肝病領域面臨的新挑戰(zhàn)。對于脂肪肝的防治不僅是一個醫(yī)學問題，更是一個社會問題。脂肪肝已成為消化、內(nèi)分泌、營養(yǎng)、心血管等多學科共同關注的問題。,5,2011年7月 重慶 第四屆全國脂肪性肝病學術

2、會議 解放軍302醫(yī)院病理診斷與研究中心主任、軍事醫(yī)學科學院博士生導師趙景民教授指出，未來十年，我國將由“病毒性肝炎大國”轉為“脂肪性肝病大國”，應高度重視脂肪性肝病的防治 。,6,正常肝臟,脂肪肝,7,脂肪肝大體標本切面,8,大泡、小泡性肝脂肪變混雜,小泡性肝脂肪變,9,重度肝脂肪變，脂變肝細胞達90%,10,脂肪肝基本概念,狹義的定義 肝細胞內(nèi)的脂肪含量（主要是甘油三酯TG）＞肝臟

3、濕重的5%，或肝組織學上每單位面積＞30%的肝實質(zhì)細胞出現(xiàn)脂肪變性時，稱為脂肪性肝病(fatty liver disease ，F(xiàn)LD)，簡稱脂肪肝。,11,脂肪肝基本概念,廣義的定義 脂肪肝是遺傳－環(huán)境－代謝應激相關因素所致的，病變主體在肝小葉，以肝細胞脂肪變性為主的的臨床病理綜合征,12,脂肪肝的分類,根據(jù)起病方式及病程分類 急性脂肪肝：小泡性 慢性脂肪肝：大泡性或混合性,,13,脂

4、肪肝的分類,根據(jù)病因分類 酒精性脂肪性肝?。╝lcoholic fatty liver disease,AFLD)非酒精性脂肪性肝?。╪on-alcoholic fatty liver disease,NAFLD),酒精性脂肪肝（AFL）酒精性肝炎酒精性肝纖維化酒精性肝硬化,單純性脂肪肝（NAFL）脂肪性肝炎（NASH）脂肪性肝纖維化和肝硬化,14,NASH，脂變＞50%，匯管區(qū)中度

5、炎癥細胞浸潤（HE×50),15,脂肪肝的流行病學調(diào)查 及預后,非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）：80%酒精性脂肪性肝?。ˋFLD）：5%其余的是藥物性、中毒性、遺傳性、自身免疫性等脂肪肝,16,NAFLD的流行病學及預后,歐美、日本成人NAFLD檢出率20～33％，其中至少10~15%為NASHNAFLD已成為西歐、美國、澳大利亞、日本第一大慢性肝病及肝酶異常的首要病因

6、亞太地區(qū)NAFLD檢出率12～24％,17,NAFLD的流行病學及預后,代謝綜合征（MS）可使NAFLD患病風險增加4~11倍NAFLD可使糖尿病發(fā)生風險增加3.8~11倍肥胖者： NAFL發(fā)生率60~90%，NASH為20~25%，肝硬化2~8%糖尿病和高脂血癥患者NAFLD檢出率分別為21~78%、27~92%,肥胖2型糖尿病患者可達50%~70%，且多為中度以上,18,流行病學,研究顯示：2型糖尿病患者是脂肪肝的高

7、發(fā)人群,2型糖尿病患者患NASH危險性比一般人高2.6倍,19,中國脂肪肝的流行病學調(diào)查 范建高，世界華人消化雜志，01年第1期；中華消化雜志，02年第2期,818名北京市干部：18.3%4009名上海市職員：12.8%1050名北京市職工：11.0％1119名南京市干部：10.2%11372名紹興市職工：9.58%3015名杭州市工人：5.2%4100名大慶油田工人：5.15%四川10個寺廟和尚：0.27%

8、來自廣州的一項長達3年的隊列研究顯示，2003年NAFLD患病率為16.3%，而2008年則高達20.5%,20,2011年，北京地壇醫(yī)院副院長、軍事醫(yī)學科學院博導成軍教授對北京市居民（3762名）FLD患病率及其危險因素流行病學調(diào)查結果顯示： 北京市常住居民 FLD——35.1% NAFLD——31.0% AFLD——4.1% ——在過去的7~10年，中國發(fā)達地區(qū)

9、成人脂肪肝患病率增加了一倍,21,NAFLD的預后,NAFL近期預后良好NAFL有12~40%患者8~13年進展為NASHNASH約有25%患者在8~13年發(fā)展為脂肪性肝硬化脂肪性肝硬化患者發(fā)生原發(fā)性肝細胞癌、肝功能衰竭的概率高達30~40%,22,NAFLD相關腫瘤,2014年上海國際消化系統(tǒng)疾病會議： 福建漳州報道1例手術證實NAFLD相關肝癌，癌旁組織并無肝硬化。 美國國立衛(wèi)生研究

10、院的Bin Gao教授也有類似的報道 提示：NAFLD可以不經(jīng)過肝纖維化、肝硬化就發(fā)生肝癌 有研究表明， NAFLD與多種腫瘤的發(fā)生相關，包括直腸癌、乳腺癌等，也是目前研究的一項熱點,23,24,酒精性肝病ALD的流行病學及預后,歐美國家嗜酒人群中ALD患病率高達84%，其中20~30%發(fā)展為肝硬化在美國，ALD為慢性肝病最常見病因，每年 1.5~2萬人死于ALD我國居民ALD發(fā)病率為4~5

11、%，北方＞南方女性對酒精敏感性高，但由于男性嗜酒者多見，ALD男女比例約2:1,25,酒精性肝病ALD的診斷標準第一條：,有長期飲酒史，一般超過5年， 折合乙醇量≥40g/d，女性≥20g/d； 或2周內(nèi)有大量飲酒史（＞80g/d）,26,酒精量： 飲酒量×酒精度（%）×0.8,以56度二鍋頭為例 飲用180ml就超過80g 飲用700ml就超過300g*喜力啤酒1

12、000ml——40g,27,ALD的流行病學及預后,酒精量＞80~160g/d，其發(fā)生率增長5~25倍 酒精量＞300g/d，8天后就出現(xiàn)酒精性脂肪肝AFLD比NAFLD 患者10年內(nèi)肝硬化發(fā)生率顯著增高（20%對1%） **美國胃腸病學會統(tǒng)計，男性平均每天飲用80g酒精，可能在10年內(nèi)發(fā)生肝硬化，而女性消耗同等量酒精，5年內(nèi)就發(fā)生肝硬化,28,脂肪肝的病因,29,一、營養(yǎng)性因素1、肥胖病 NAFLD最常見和

13、最肯定的病因 肥胖伴酗酒者脂肪肝發(fā)生率達90%以上2、胃腸外營養(yǎng) 全胃腸外營養(yǎng)持續(xù)時間過長可導致肝細胞脂肪變和NASH3、營養(yǎng)不良 蛋白質(zhì)攝入不足或吸收不良，或膽堿、卵磷脂等缺乏,30,二、化學性致病因素,1、工業(yè)毒物 苯、二氯甲烷、二氯乙烯、鋇鹽等 NAFL CCl4、砷化物、三氯甲烷、磷等

14、 肝細胞壞死合并脂肪變2、藥物 長期使用糖皮質(zhì)激素、大量四環(huán)素、雌激素制劑、氨甲喋呤、胺碘酮等3、酒精中毒：90%酒精在肝臟轉化為乙醛,,,31,三、內(nèi)分泌代謝因素,1、糖尿病 2型糖尿病50~70%合并脂肪肝，且大多為中度或中度以上的脂肪肝 NAFLD與胰島素抵抗（IR）、高胰島素血癥有較強的關聯(lián)2、高脂血癥 關系最密切的是高甘油三酯血癥，脂

15、肪肝發(fā)病率為60~80%，常伴有肥胖和糖尿病3、皮質(zhì)醇增多癥、妊娠等亦可導致脂肪肝,32,四、生物性致病因素,肝炎病毒HBV和HCV感染可引起脂肪肝 特別是HCV感染患者中80%伴脂肪肝五、遺傳因素 先天性代謝性肝病：肝豆狀核變性、半乳糖血癥、 肝糖原貯積病等 遺傳易感性：肥胖、糖尿病、原發(fā)性高脂血癥六、其他

16、 免疫性疾病如SLE、自身免疫性肝炎等 部分病因不明脂肪肝——隱源性脂肪肝,33,酒精中毒、肥胖、糖尿病 ——脂肪肝的三大病因,34,脂肪肝的發(fā)病機制,,35,1998年Day提出的“二次打擊”學說第一次打擊 各種病因作用 肝細胞脂肪代謝異常，肝內(nèi)脂肪沉積第二次打擊 肝細胞脂肪變性

17、 脂肪性肝炎、肝纖維化,,氧化應激和脂質(zhì)過氧化、細胞因子等作用下,,36,NAFLD的發(fā)病機制,脂質(zhì)代謝障礙激素的作用： 胰島素抵抗（IR） 瘦素抵抗氧化應激及脂質(zhì)過氧化損傷細胞因子的作用,,第一次打擊,,第二次打擊,,,,,,37,肝臟在脂肪代謝中占據(jù)中心地位,饑餓,脂庫脂肪動員,脂肪酸,肝臟,,,,β-氧化,酮體,肝外組織（腦、肌肉）利

18、用,,輸出,飽食,葡萄糖代謝,乙酰CoA,,,合成,脂肪酸、膽固醇,VLDL （TG+膽固醇+磷脂+載脂蛋白）,脂肪組織貯存,,,,輸出,,38,β-氧化,脂肪酸,脂酰輔酶A,線粒體β-氧化,乙酰輔酶A,三羧酸循環(huán),酮體,肝外組織,氧化供能,,,,左旋肉堿,,,,,39,脂質(zhì)代謝障礙,1、血中游離脂肪酸（FFA）增加2、碳水化合物攝取過多3、肝細胞線粒體β-氧化障礙4、VLDL合成障礙,,40,胰島素抵抗（IR） NA

19、FLD的發(fā)病機制,定義：指胰島素作用的靶組織或靶器官（主要是肝臟、肌肉和脂肪組織）對胰島素生物作用的敏感性下降，即正常劑量的胰島素產(chǎn)生低于正常生物學效應的一種狀態(tài)原因：胰島素生物活性下降，或靶器官、靶組織上的受體障礙及受體下調(diào)，或受體后缺陷，對胰島素表現(xiàn)為一定的抵抗性，敏感性下降**IR是代謝綜合征的“共同土壤”,41,胰島素是調(diào)節(jié)脂肪合成的主要激素胰島素,胰島素抵抗（IR） NAFLD的發(fā)病機制,脂肪組織內(nèi)

20、的激素敏感性脂肪酶,脂肪動員,,,（-）,（-）,脂肪組織內(nèi)的脂蛋白脂酶,脂肪酸進入脂肪組織合成與貯存,,,（+）,（+）,血中游離脂肪酸,,,,42,IR,胰島素抵抗（IR） NAFLD的發(fā)病機制,激素敏感性脂肪酶（TG脂酶）活性增強,脂肪動員,,,脂蛋白脂酶活性降低,脂肪組織合成與貯存,,,血中游離脂肪酸,,,,,,肝內(nèi)TG合成,,,入肝,脂肪肝,,43,瘦素是肥胖基因（ob基因）表達的蛋白質(zhì)類激素，

21、主要由白色脂肪組織分泌合成作用：抑制食欲、減少能量攝入、抑制脂肪合成、 增加能量消耗 **瘦素抵抗患者 （1）食欲增強，脂肪合成增多，肥胖 （2）高瘦素血癥，干擾胰島素的生理功能，誘 導IR ，促進肝內(nèi)脂肪貯積,瘦素抵抗 NAFLD的發(fā)病機制,,44,氧化應激及脂質(zhì)過氧化損傷 NAFLD的發(fā)病

22、機制,肝組織內(nèi)脂肪酸和TG增多 線粒體β-氧化速度代償性 活性氧（ROS） ROS,,,,,激活磷脂酶A2 膜磷脂 花生四烯酸 PG、LT等 激活NF-κB： 細胞因子表達增強 TNFα、IL-8等,O·2 OH· 1O2 H2O2,,脂質(zhì)過氧化反應

23、,,,,炎癥反應,,,,,+不飽和脂肪酸,45,細胞因子的作用 NAFLD的發(fā)病機制,,肝組織脂肪酸、ROS增多,激活Kupffer細胞,釋放大量細胞因子如TNFα、TGF-β1、PDGF等,肝細胞炎癥、壞死、肝纖維化,,,,46,細胞因子的作用 NAFLD的發(fā)病機制,轉化生長因子（TGF-β1） 肝纖維化主要始動因子之一 TGF-β1 肝星狀細胞（H

24、SC）活化增殖 肌成纖維細胞并分泌膠原纖維血小板衍生生長因子 （PDGF） 目前已知的HSC最強的絲裂原，能刺激HSC活化增殖轉化為肌成纖維細胞，促進肝纖維化的發(fā)生,,,,,47,酒精性脂肪肝的發(fā)病機制,長期大量攝入酒精是導致ALD的主要原因酒精對肝臟直接毒性作用氧化應激和脂質(zhì)過氧化的作用細胞因子的作用,第一次打擊,第二次打擊,,,,48,

25、酒精對肝臟直接毒性作用 AFLD發(fā)病機制,乙醇,乙醛,乙酸,,乙醇脫氫酶ADH,微粒體乙醇氧化酶系MEOS,,NAD+,NADH,,乙醛脫氫酶,NAD+,NADH,,促進自由基產(chǎn)生，促進膜的脂質(zhì)過氧化與丙二醛（MDA）等形成加合物 損傷肝臟抑制VLDL合成 肝內(nèi)TG轉運障礙，肝TG堆積,乙醛,,,,NADH/NAD+ 抑制線粒體三羧酸循環(huán)

26、 β-氧化 肝內(nèi)TG堆積,,,,,,,49,氧化應激和脂質(zhì)過氧化損傷 AFLD發(fā)病機制,酒精含量高時，其代謝主要由微粒體乙醇氧化酶系（MEOS）起作用MEOS主要成分為細胞色素P450 2E1（CYP2E1），在酒精誘導下活化，產(chǎn)生大量ROS，引發(fā)氧化應激和脂質(zhì)過氧化，造成肝組織炎癥、細胞損傷,50,細胞因子的作用 AFLD發(fā)病機制,ROS等激

27、活Kupffer細胞釋放大量細胞因子如TGF-β1、PDGF等 促進肝纖維化** TNFα在ALD中占重要地位 長期大量飲酒 腸道菌群過度生長，腸粘膜屏障通透性 腸細菌移位 腸源性內(nèi)毒素血癥 激活Kupffer細胞釋放大量TNFα 組織炎癥反應、肝細胞凋亡、壞死 激活

28、中性粒細胞，增加ROS的生成,,,,,,,,,,,51,脂肪肝實驗模型的建立方法,52,理想的實驗模型,與人類疾病特征相似病變有一定發(fā)展過程，與人類發(fā)病過程相似形成率高，動物死亡率低，重復性好造模方法簡單易行，對實驗人員無傷害造模停止后組織學病變逆轉緩慢，便于藥物干預研究,,,53,脂肪肝實驗模型,NAFLDAFLD,特殊品系脂肪肝動物模型營養(yǎng)失調(diào)性脂肪肝動物模型毒物或藥物性脂肪肝動物模型體外誘導模型復合模型,

29、急性酒精性肝病動物模型慢性酒精性肝病動物模型體外誘導模型,,,,,,,,54,特殊品系脂肪肝動物模型 NAFLD模型 （基因突變或基因敲除）,1、ob/ob小鼠、db/db小鼠（或fa/fa大鼠）ob/ob小鼠—ob基因自發(fā)突變db/db小鼠—db基因自發(fā)突變fa/fa大鼠—fa基因自發(fā)突變,,,瘦素受體缺乏,瘦素抵抗,,瘦素缺乏,,**可出現(xiàn)與人類NAFLD相似的特征： 過度攝食、肥胖、

30、高脂血癥、高胰島素血癥等,55,特點：該模型雖有明顯的IR，但不能自發(fā)地由單 純性脂肪肝發(fā)展為NASH、肝纖維化解決方案：+蛋氨酸-膽堿缺乏（MCD）飲食、 或內(nèi)毒素、或酒精、或高脂飲食、或再灌 注損傷方可演變?yōu)镹ASH、肝纖維化意義：研究由肝脂肪變向NASH進展、 NASH向 纖維化進展的良好

31、模型,56,特殊品系脂肪肝動物模型 NAFLD模型,2、幼齡內(nèi)臟脂肪變小鼠（JVS）模型 ——系統(tǒng)性肉毒堿缺乏模型表現(xiàn)：出生3~28天，小鼠生長緩慢，肝腫大，肝 細胞脂肪變性機理：肉毒堿是轉運脂肪酸進入線粒體進行β氧化 所必須的物質(zhì)。,57,特殊品系脂肪肝動物模型 NAFLD模型,3、FLS小鼠模型

32、 1999年Soga等用同系交配法建立了一種無過度攝食、不出現(xiàn)肥胖和糖尿病而伴有脂肪肝的新品種。 表現(xiàn)：新生的FLS小鼠的肝細胞內(nèi)即有細小的脂肪顆粒聚集，隨年齡增長進行性加重，肝臟 TG含量較同齡小鼠升高5倍，伴ALT和AST增高、炎癥反應，而血脂無異常。 12個月多自發(fā)形成肝細胞癌（HCC），但未見肝硬化意義：可作為人類非肥胖、糖尿病而伴有脂肪肝和人類NASH相關HCC機制研究的模型,58,特殊

33、品系脂肪肝動物模型 NAFLD模型,特殊品系動物模型因基因突變或缺失，引起脂肪代謝障礙，能自發(fā)形成脂肪肝缺點： 1、可建立先天性和幼年型脂肪肝模型，但不適于后天營養(yǎng)障礙所致的脂肪肝的研究 2、多缺乏NASH和肝纖維化的自然演變過程，僅適合NAFLD特定發(fā)病機制的研究3、實驗動物成本高，來源較困難，死亡率高，缺乏廣泛應用的可行性,,59,營養(yǎng)失調(diào)性脂肪肝動物模型 NAFLD模型,1、蛋氨酸-膽堿

34、缺乏（MCD）飲食模型 ——國際上經(jīng)典的NASH動物模型機理：蛋氨酸、膽堿缺乏導致線粒體β-氧化障礙、 VLDL合成減少表現(xiàn)：MCD飲食小鼠，2周后形成NASH， 肝內(nèi)可見活化的巨噬細胞浸潤，伴NF-κB激活、炎性細胞因子、粘附分子等表達增加，12W出現(xiàn)肝纖維化特點：MCD飲食模型有明顯的氧化應激、線粒體損傷及細胞凋亡；與人類NAS

35、H相比，動物多出現(xiàn)ALT過高、TG過低、不引起IR等表現(xiàn),60,意義：用于NSAH及肝纖維化的機制及藥物篩選、藥物干預研究，并為非肥胖而伴NASH等特殊脂肪營養(yǎng)障礙疾病提供研究思路缺點：MCD飲食價格昂貴，且不符合人類膳食結構,61,營養(yǎng)失調(diào)性脂肪肝動物模型 NAFLD模型,2、高脂飲食（HFD）模型　 ——國內(nèi)最常用的模型配方：多種，構造原理基本一致，主要差別在于飲食中脂肪占供能物質(zhì)的比例不等

36、（10%~71%），含或不含高碳水化合物特點： A、造模周期長，約4~12W，甚至半年，成功率高 B、病變有一定的發(fā)展過程，在發(fā)病機制、臨床表現(xiàn)上與人類NAFLD 最相似，且多合并肥胖、IR等,62,高脂飲食常用配方,A、華天懿等：高脂飼料喂養(yǎng)大鼠12W 基礎飼料50% +豬油10%+奶粉10%+雞蛋30%表現(xiàn)：大鼠第2W 開始體重增長加速，至第4W 體重已明顯高于對照組，肝TG、膽固醇明顯增加，肝細胞脂

37、肪變。意義：與兒童單純性肥胖癥的自然發(fā)病過程相似，對該病及并發(fā)的脂肪肝的防治研究有一定的意義,63,高脂飲食常用配方,B、祁培宏等：普通飼料喂養(yǎng)大鼠1W，再用脂肪乳劑灌胃4W 乳清酸5 %+膽固醇10% +豬油20%+蛋黃粉1%表現(xiàn)：肝臟體積變大，濕重增加，色黃，切面油膩；HE染色肝細胞呈大泡性脂肪變，血清、肝臟TG、膽固醇顯著升高,64,高脂飲食常用配方,C、徐正婕、鐘嵐、范建高等：HFD飼養(yǎng)雄性SD大鼠 標準

38、飼料88 %+豬油10%+膽固醇2%表現(xiàn)： 4 w出現(xiàn)肝脂肪變；8 w呈現(xiàn)單純性脂肪肝；12 w形成NASH，伴ALT水平升高；24 w出現(xiàn)明顯竇周纖維化；36~48 w纖維化加劇意義：本模型與人類肥胖癥合并高脂血癥及脂肪肝的病例極為相似，可用于血脂調(diào)整藥物防治動脈粥樣硬化和脂肪肝的藥理研究,65,高脂飲食常用配方,D、美國Charles等：高脂液體飼料喂養(yǎng)SD大鼠 脂肪71 %+碳水化合物11%+蛋白18%表現(xiàn)：3

39、周可形成全小葉肝細胞脂肪變，伴有TNFa和I型膠原mRNA 的表達增強，可誘發(fā)線粒體損傷和氧化應激意義：造模方法簡單，所需時間較短，與人體高脂血癥性脂肪肝機制相似，是一種用于該病研究的經(jīng)典模型缺點：每天灌胃較為繁瑣，操作不當可引起動物窒息死亡,66,營養(yǎng)失調(diào)性脂肪肝動物模型 NAFLD模型,3、高糖飲食大鼠模型 高蔗糖/果糖飲食 **在Wistar大鼠的飲用水中加入10%蔗糖，48小時內(nèi)即能在其體

40、內(nèi)觀察到脂肪酸合成增加 **SD大鼠在含蔗糖70%的飲食喂養(yǎng)后出現(xiàn)肥胖，2~3周可形成脂肪肝，并伴有參與脂肪合成的酶類增加，雄性鼠肝損傷更為嚴重意義：形成機制與部分人群，尤其是女性不良飲食習慣導致的脂肪肝相似。但是雄性鼠比雌性鼠對高糖誘導的肝損傷具有更高的易感性,67,營養(yǎng)失調(diào)性脂肪肝動物模型 NAFLD模型,4、禁食后高糖飼料誘發(fā)大鼠脂肪肝模型**Leclercq等將雄性Wister大鼠禁食48h后給予高糖飼料，

41、2d后大鼠肝內(nèi)脂肪含量較正常增加235%，呈現(xiàn)肝細胞單純性脂肪變性意義：禁食后再進食導致脂肪肝的可能機制為肝臟合成脂肪酸和脂肪酸的循環(huán)失衡，TG的合成和分泌失衡,68,營養(yǎng)失調(diào)性脂肪肝動物模型 NAFLD模型,5、玉米油注射大鼠脂肪肝模型 墨西哥Terrazos—Luch等采用皮下注射玉米油的方法建立大鼠脂肪肝模型6、全胃腸外營養(yǎng)（TPN）脂肪肝模型 予成年大鼠深靜脈插管，導管接電腦輸液泵，將營養(yǎng)液

42、以3ml/h的滴速持續(xù)滴注。靜脈營養(yǎng)液中非蛋白能量占33%以上，1W后大鼠肝臟即出現(xiàn)明顯的脂肪變性。 此造模方法時間短、成功率高，但操作復雜，限制了實驗的廣泛應用,,69,毒物或藥物性脂肪肝動物模型 NAFLD模型,1、四氯化碳（CCl4）誘發(fā)模型　 CCl4 0.5ml/kg，每周3次，大鼠皮下注射 表現(xiàn)：短時間內(nèi)即可觀察到中央靜脈周圍中重度大泡性肝細胞脂肪變，伴炎癥及壞死；6W可出現(xiàn)肝纖維

43、化；12W可見肝硬化。機理：CCl4誘導CYP2E1激活及嚴重脂質(zhì)過氧化反應造成肝細胞結構和功能破壞優(yōu)缺點：模型復制率100%，但死亡率高達20~40%,70,毒物或藥物性脂肪肝動物模型 NAFLD模型,2、四環(huán)素誘發(fā)模型　 *雄性大鼠一次性口服四環(huán)素1 g/kg，在24h即可見肝細胞小泡性脂肪變，并伴膽固醇、TG合成增加及脂肪酸β-氧化受抑制。 *另有報道，經(jīng)四環(huán)素單次誘導即可使肝臟TG水平

44、增加270%，并出現(xiàn)小泡性脂變。機理：四環(huán)素沉積于肝細胞線粒體，抑制線粒體DNA復制，干擾mRNA翻譯成載脂蛋白，繼而影響肝內(nèi)TG的轉運及線粒體脂肪酸的β-氧化,71,毒物或藥物性脂肪肝動物模型 NAFLD模型,藥物或毒物誘導模型具有成型時間短、方法簡便、病變明顯等特點 但其發(fā)病機制、病理、病理生理改變與人類常見脂肪肝類型差異較大，未出現(xiàn)肥胖和IR，且動物肝損傷嚴重，死亡率高,,72,體外誘導模型

45、 NAFLD模型 ——肝細胞株脂肪變性模型,**2002年日本Okamoto等，用含有1 mmol／L油酸的細胞培養(yǎng)液培養(yǎng)人HepG2細胞24h，成功地建立了一個體外的脂肪肝模型，細胞內(nèi)TG增加**以正常成人肝細胞株（L-02）等為材料，在培養(yǎng)液中加入不同濃度的TG、油酸、亞油酸、花生四烯酸等脂質(zhì)建立體外脂肪肝模型意義：應用此模型可在細胞水平進行脂肪

46、肝發(fā)病機制及干預治療的體外研究,73,復合模型 NAFLD模型,目的：在基因模型的基礎上聯(lián)合應用營養(yǎng)、藥物誘發(fā)模型，試圖使新模型的表型與人類NAFLD更接近，并能反映疾病從單純性脂肪肝向NASH進展，NASH向肝纖維化進展的過程常見復合模型：ob/ob小鼠+MCD飲食，db/db小鼠+MCD飲食，fa/fa大鼠+HFD等意義：復合模型均可產(chǎn)生IR、肥胖以及NASH和纖維化，最大程度地模

47、擬了人類NAFLD的復雜性，病理變化顯著，是一種極具潛力的NASH模型,,74,急性酒精性肝病動物模型 AFLD模型,健康成熟雄性Wistar或SD大鼠， 自由飲水+普通飼料 1、56度白酒灌胃，每次7ml/kg，每日2次 2、腹腔注射一定濃度乙醇，每次20ml/kg，每日2次 1~2W后成功復制大鼠急性酒精性肝損傷模型，表現(xiàn)為肝細胞脂肪變性和炎癥細胞浸潤。 灌胃法明顯優(yōu)

48、于腹腔注射法，后者死亡率高，且不符合人類的飲酒習慣,75,慢性酒精性肝病動物模型 AFLD模型,1、酒精液體飲料模型 A、大鼠模型：Keegan等在飲水中加40%酒精，29W后實驗鼠出現(xiàn)肝細胞脂肪變、炎癥、壞死和中央靜脈周圍硬化優(yōu)點：造模方法簡單，與人類酒精性肝病相近缺點：耗時長，且大鼠厭酒，攝入量難以控制 B、微豬模型：固體飼料+占每日熱量40%的酒精飲料，1個月后血ALT升高，12個月后出現(xiàn)肝細胞脂肪變，局

49、灶性炎細胞浸潤及中央靜脈周圍纖維化優(yōu)點：微豬可隨意食用酒精飲料，與人類酒精性肝損傷較接近和較自然的動物模型缺點：造模時間長，費用較高,76,慢性酒精性肝病動物模型 AFLD模型,2、酒精灌胃模型 A、Tsukamato-French大鼠模型Tsukamato-French等給SD大鼠手術植入胃管，持續(xù)注入含酒精的液體食料，維持大鼠血中200～300mg/dl的酒精濃度。表現(xiàn)：造模3個月，成功的建立了從肝細胞脂肪

50、變性、小葉中央壞死、炎性細胞浸潤至肝纖維化的進行性酒精性肝損傷模型優(yōu)點：可完全控制酒精和各種營養(yǎng)物質(zhì)的攝入量，且病變符合進行性酒精性肝損傷的演變規(guī)律缺點：造模技術復雜、實驗設備較昂貴、強制性持續(xù)注入含酒精食料，不符合人類脂肪肝形成過程,77,酒精灌胃模型,B、美國Iimuro等選用年齡和體重匹配的雌性和雄性Wister大鼠，酒精灌胃（11-12g/kg/d）4W，雌性大鼠血清AST高于雄性大鼠，肝組織脂肪變、炎癥及壞死亦以雌性鼠發(fā)展

51、更快、更嚴重，累及全小葉，說明雌性大鼠對乙醇導致的肝損傷更敏感 C、范建高等在大鼠高脂飲食基礎上，用60%的酒精15mg/kg灌胃，每日2次，3個月后出現(xiàn)輕、中度肝細胞脂肪變，6個月時出現(xiàn)中度以上脂肪變、局灶性炎癥伴肝細胞壞死和纖維化,78,慢性酒精性肝病動物模型 AFLD模型,3、 Liber-Decarli大鼠模型 Liber和Decarli配制出含酒精和全營養(yǎng)素的液體食料：糖類47%（其中36%的熱量

52、由酒精代替），蛋白質(zhì)18%，脂肪35%，及適量的維生素和無機鹽。 造模大鼠只喂該食料，酒精攝入量達12～18g/kg，造模4W即出現(xiàn)明顯的肝細胞脂肪變性。 優(yōu)點：Liber-Decarli液體食料已商品化出售，還可用于小鼠、家兔、豚鼠等。該模型簡便易行，費用低，形成率高及穩(wěn)定性好,79,體外誘導模型 AFLD模型,2010年廖于等用含0.28%乙醇的培養(yǎng)液，培養(yǎng)人正常肝細胞株（L-

53、02）。誘導、傳代至第30代（Ld30，6天為一周期），L-02細胞發(fā)生脂肪變，細胞內(nèi)TG顯著增加，即AFLD模型成功建立。,80,我們的造模方法,1、NAFLD大鼠模型 20%玉米油（高溫煮沸）+80%普通飼料，自由飲用清水。 大鼠進食量多，體重增加明顯。 6W后肝組織內(nèi)彌漫性細胞脂肪變性，部分肝組織出現(xiàn)點狀或灶狀壞死，炎癥細胞浸潤，血清TG、AST、ALT，肝臟TG均顯著增高。造模成功。,

54、81,我們的造模方法,2、高脂-酒精混合性脂肪肝大鼠模型 高脂飼料（同上），56度白酒灌胃（10ml/kg），每日1次，自由飲用清水。 **6W后，血清TG、AST、ALT，肝臟TG均顯著增高，肝細胞彌漫性脂肪變性，匯管區(qū)炎癥細胞浸潤較明顯，壞死灶多見，部分可見纖維組織增生。 脂肪肝復制成功率100%，脂肪性肝炎發(fā)生率45%優(yōu)點：兩種模型，均是模擬現(xiàn)代人類飲食結構的改變及脂肪肝的成因，符合人類脂肪肝的演變過程，方法簡單

55、易行，原料價廉易得，耗時較短，成功率高。,82,高脂+酒精組，大泡、小泡性脂變混雜，匯管區(qū)炎癥細胞浸潤,高脂+酒精組，電鏡下肝細胞間膠原纖維增生,83,脂肪肝的診斷,,84,脂肪肝的診斷,影像學檢查：B超、CT 組織病理學診斷 肝活檢是脂肪肝診斷及分級的金標準 實驗室檢查中華醫(yī)學會肝病學分會脂肪肝和酒精性肝病學組 2010年在原來的診療指南（2006年）基礎上進行修訂，新制定了NAFLD與酒精性肝病的診療指南,85

56、,關于脂肪肝組織標本染色,大多數(shù)脂肪肝肝內(nèi)沉積的脂肪為TG，普通HE染色顯示肝細胞質(zhì)出現(xiàn)空泡，一般無需特殊染色小泡性脂肪肝，空泡不明顯，需作冷凍切片油紅O染色顯示纖維結締組織，以診斷纖維化：Masson三色染色、VG染色、網(wǎng)狀纖維染色（Gordon-Sweets銀染法）,,86,小泡性脂變，微小脂泡被油紅O染成紅色（油紅O×300）,,87,酒精性肝硬化，小結節(jié)性，肝細胞脂變，纖維間隔寬（Masson×4

57、0）,88,實驗室檢查,影響脂肪肝形成的指標 脂肪肝形成后的指標變化,,89,影響脂肪肝形成的指標,1、血脂類 血清總膽固醇（TC）、TG、游離脂肪酸（FFA）等 動物實驗時可直接測定肝勻漿中的TC、TG2、胰島素抵抗（IR） 血糖、胰島素等3、其他 瘦素、TNFα（或可溶性腫瘤壞死因子受體sTNFR）等,90,脂肪肝形成后的指標變化,1、肝酶類 丙氨酸氨基轉移酶（ALT）、天冬氨

58、酸氨基轉移酶（AST）、γ-谷氨酰轉肽酶（GGT）等2、氧化應激指標過氧化水平：丙二醛（MDA）、ROS抗氧化水平：超氧化物歧化酶（SOD）、 谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）**動物實驗可直接測定肝勻漿中的各指標,91,脂肪肝形成后的指標變化,3、纖維化指標A、血清透明質(zhì)酸（HA） 最具有臨床實用價值的一個指標，在纖維化早期即顯著升高，可反映肝纖維化的程度、活動

59、性B、膠原及代謝物 血清Ⅲ型前膠原氨基端肽（ PⅢP）：肝硬化早期↑ 血清Ⅲ型前膠原（PCⅢ）：與肝纖維化程度正相關 Ⅳ型和Ⅰ型膠原等C、細胞因子： TGFβ1、PDGF等,92,脂肪肝的防治,,93,一、預防為主戒除劣習、合理膳食、合理運動、心情健康,,,94,二、去除病因，控制原發(fā)病 輕中度單純性脂肪肝可恢復正常三、藥物治療1、改善IR（胰島素增敏劑） 雙胍類、噻唑烷二酮（羅格列酮等）、脂聯(lián)素等

60、2、調(diào)整血脂紊亂（降脂藥物） 辛伐他汀、立普妥（阿托伐他?。⒎侵Z貝特等3、減少腸源性內(nèi)毒素血癥 抗生素：新霉素、多粘菌素B,95,4、減少活性氧的損傷作用（抗氧化劑） GSH前體藥：N-乙酰半胱氨酸（NAC）、 S-腺苷甲硫氨酸 VitE、VitC、普羅布考、水飛薊素（益肝靈）5、修復細胞生物膜（生物膜保護劑） 易善復（肝得?。?、細胞因子