調(diào)血脂藥物體外篩選模型的建立及應用.pdf

1、目的:利用肝癌細胞HepG2建立細胞內(nèi)脂質(zhì)堆積模型,篩選中藥中的活性成分,得到具有調(diào)脂作用的活性化合物,從吸收及代謝通路上的基因表達變化探討其作用機制,進行體內(nèi)藥效研究。
　　 方法:加入外源性的油酸(OA)與棕櫚酸(PA)與HepG2細胞共同培養(yǎng),造成細胞內(nèi)脂質(zhì)堆積;MTT法檢測不同濃度脂質(zhì)對細胞活性的影響,選擇合適的脂質(zhì)堆積模型作為篩選工具。選擇造模濃度后,在造模同時加入不同的中藥活性成分共同培養(yǎng),利用尼羅紅對細胞內(nèi)脂質(zhì)進行

2、染色,借助用流式細胞儀技術(shù)檢測細胞內(nèi)熒光強度,來判斷細胞內(nèi)脂質(zhì)含量的變化。利用模型篩選出具有調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝的活性化合物;在此基礎上,利用熒光實時定量RT-PCR技術(shù)考察吸收通路上的脂肪酸結(jié)合蛋白L-FABP的基因表達變化,以及在代謝通路上PPAR-α基因的表達變化,借此初步探討藥物的作用機制;利用高血脂大鼠模型對篩選出的藥物進行體內(nèi)藥效評價。
　　 結(jié)果:細胞培養(yǎng)同時加入總濃度分別為1mM、2mM、3mM的油酸(OA)與棕櫚酸(P

3、A),經(jīng)MTT法檢測后發(fā)現(xiàn)隨著脂質(zhì)濃度的增加,造成的細胞毒性也隨之而增加,1mM組細胞活性基本無顯著影響,故選擇為體外脂質(zhì)堆積造模濃度。經(jīng)尼羅紅染色后流式檢測,與空白組相比較各個模型組細胞內(nèi)脂質(zhì)含量都得到了顯著的提高,1mM組中細胞內(nèi)脂質(zhì)含量是空白組的2.69倍,而2mM組脂質(zhì)含量能夠達到空白組的3.22倍,3mM組的達到了空白的3.69倍(P＜0.01),說明外源性FFAs的濃度與細胞內(nèi)脂質(zhì)含量呈正相關;隨著造模時間從6h、12h、1

4、8h至24h的延長,細胞內(nèi)脂質(zhì)含量成正比增加,從空白組的1.5倍、1.9倍、2.1倍直至2.5倍。利用1mM脂質(zhì)堆積模型進行天然活性化合物的篩選,得到部分在體外對細胞內(nèi)脂質(zhì)堆積具有調(diào)節(jié)作用的化合物,如甘草次酸、絞股藍皂苷、連翹苷、槲皮苷、水飛薊素等,能分別降低1mM模型組細胞內(nèi)的脂質(zhì)含量達27.85％、20.13％、19.32％、13.58％、1.18％。
　　 已知過氧化物酶體增生物激活受體PPAR-α作為與脂質(zhì)氧化相關的轉(zhuǎn)錄

5、因子,能夠上調(diào)過氧化物酶體及與線粒體內(nèi)β氧化相關的基因表達;L-FABP主要表達于肝臟組織和小腸,介導脂肪酸及多種疏水基團轉(zhuǎn)運,涉及多種疾病的發(fā)病機制,故以這兩個基因為考察指標,對化合物的作用機制進行討論。選用苯扎貝特作為陽性藥,對脂質(zhì)堆積細胞作用24h后,苯扎貝特組的PPAR-α的表達與模型組相比提高了約3.5倍,甘草次酸組表現(xiàn)出了約2.4倍的提高,水飛薊素組約為2倍,三個給藥組均發(fā)揮上調(diào)作用;對L-FABP的考察結(jié)果表明,苯扎貝特組

6、與模型組相比基因表達量提高了1.5倍左右,在各個給藥組中最高,其次是甘草次酸組,其相對表達量接近1倍,而水飛薊素組的相對表達量接近0.5倍,表現(xiàn)出一定的抑制作用。經(jīng)過結(jié)構(gòu)修飾的化合物NDH01,低劑量組的PPAR-α的基因mRNA表達增至2.5倍,而高劑量組約為1倍;HMG-CoA還原酶的mRNA表達都得到了抑制,相對表達情況均小于1倍,高劑量組的抑制作用強于低劑量組;FABP蛋白的表達在2個劑量組中均未表現(xiàn)顯著變化。
　　 通

7、過建立高脂動物模型對NDH01化合物進行體內(nèi)藥效考察,發(fā)現(xiàn)NDH01化合物高中低三個劑量組中,低劑量組(5mg/kg)與中劑量組(15mg/kg)組降低了血清中的TC、LDL-C,與模型組相比具有極顯著差異(P＜0.01);高劑量組(45mg/kg)在TC水平上與其余2個劑量組同樣發(fā)揮了良好的降低作用(P＜0.01),對LDL-C水平均無顯著影響。
　　 結(jié)論:利用外源性游離脂肪酸與HepG2細胞共同培養(yǎng),造成細胞內(nèi)脂質(zhì)堆積模型

8、,利用尼羅紅染色及流式細胞技術(shù)檢測含量,經(jīng)過時效關系與量效關系的考察,能夠穩(wěn)定重復出此模型,證明細胞內(nèi)脂質(zhì)堆積模型成功建立。利用此模型進行化合物的篩選,得到一系列對細胞內(nèi)脂質(zhì)堆積發(fā)揮調(diào)節(jié)作用化合物,包括天然化合物及經(jīng)過結(jié)構(gòu)修飾的化合物。從熒光實時定量RT-PCR的結(jié)果發(fā)現(xiàn),這些藥物在脂質(zhì)氧化通路上發(fā)揮了一定的作用,降低了細胞內(nèi)的脂質(zhì)含量,減少了甘油三酯合成的前體化合物,從減少TG的合成發(fā)揮調(diào)血脂作用。利用高脂動物體內(nèi)試驗驗證得出NDH0