藥物致QT間期延長(zhǎng)體外HIRG通道評(píng)價(jià)模型的建立及其應(yīng)用.pdf

1、臨床使用的許多藥物能夠引起心臟QT間期延長(zhǎng)，導(dǎo)致室性心律失常，增加發(fā)生尖端扭轉(zhuǎn)型室性心動(dòng)過(guò)速(Torsade de pointes，TdP)的危險(xiǎn)。近十年來(lái)，藥物誘發(fā)QT間期延長(zhǎng)已超過(guò)肝損傷，成為導(dǎo)致藥品撤市的主要原因和制藥工業(yè)必須面對(duì)的首要安全問(wèn)題。QT間期在細(xì)胞水平代表心室肌細(xì)胞的動(dòng)作電位時(shí)程(action potential duration，APD)加上傳導(dǎo)時(shí)間，APD的長(zhǎng)短與膜電位的復(fù)極化密切相關(guān)。快速延遲整流鉀電流(the

2、rapidly activating delayed rectifier potassium current，IKr)是動(dòng)作電位復(fù)極期的主要外向鉀電流，HERG基因(human ether-a-go-go-related gene)普遍認(rèn)為編碼IKr的α亞單位，其表達(dá)形成的HERG鉀通道與IKr性質(zhì)相似。很多實(shí)驗(yàn)證實(shí)凡是能夠誘導(dǎo)QT間期延長(zhǎng)，引發(fā)TdP的藥物，均能夠在不同程度上阻斷IKr/HERG通道。ICH國(guó)際藥物研發(fā)指導(dǎo)原則S7B于

3、2005年明確提出將IKr/HERG通道作為判斷藥物是否能延長(zhǎng)心室復(fù)極化的重要指標(biāo)。因此，采用膜片鉗電生理試驗(yàn)方法進(jìn)行體外HERG通道檢測(cè)成為綜合評(píng)估TdP危險(xiǎn)性的重要部分。
　　 目前，HERG通道檢測(cè)已成為藥物早期篩選和安全性藥理實(shí)驗(yàn)的重要內(nèi)容。而我國(guó)相關(guān)試驗(yàn)并未廣泛開(kāi)展，尤其是對(duì)中草藥致QT間期延長(zhǎng)的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估嚴(yán)重滯后。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外中草藥毒性引發(fā)心血管不良反應(yīng)案例頻發(fā)?；谝陨犀F(xiàn)狀，建立藥物致QT間期延長(zhǎng)的體外HERG通道

4、模型并應(yīng)用于傳統(tǒng)中藥(traditional Chinese medicine，TCM)的心臟毒性評(píng)估和機(jī)制研究，具有重要的理論和現(xiàn)實(shí)意義。因此，本研究擬采用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)，建立HERG離子通道模型，并選用具有明顯心血管藥理活性的中藥單體環(huán)維黃楊星D和蝙蝠葛堿，對(duì)其進(jìn)行HERG電流抑制作用評(píng)價(jià)和機(jī)制研究。
　　 首先，利用膜片鉗全細(xì)胞記錄技術(shù)建立HERG通道模型。采用原代培養(yǎng)心肌細(xì)胞，形成全細(xì)胞模式后，記錄到電壓門(mén)控性鈉、鉀、

5、鈣電流。利用轉(zhuǎn)染并穩(wěn)定表達(dá)HERG通道的人胚腎細(xì)胞株(HEK-293)記錄HERG電流。該模型可以直接觀察藥物對(duì)HERG電流的抑制效應(yīng)。HERG的電流電壓關(guān)系表明，步階電流呈“鐘型”，-40～+10 mV，隨電壓的升高，電流幅度迅速增加；+10～+40 mV，由于C型失活，電流幅度隨電壓升高反而下降。尾電流在去極化時(shí)迅速上升，在+10 mV時(shí)已接近峰值。以上電流的特點(diǎn)與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致。此外，為判斷HERG電流對(duì)藥物的敏感性，試驗(yàn)采用陽(yáng)

6、性藥物E-4031和特非那定進(jìn)行有效性驗(yàn)證。E-4031和特非那定均能明顯阻斷HERG電流，呈劑量依賴(lài)性，半數(shù)抑制濃度IC50分別為0.042μM和0.038μM，結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道一致。本部分從電生理和藥理學(xué)阻斷劑兩方面均驗(yàn)證了記錄電流為IKr，表明藥物致心臟QT間期延長(zhǎng)體外HERG通道評(píng)價(jià)模型已成功建立。
　　 在此基礎(chǔ)上，本研究利用建立的HERG通道模型，對(duì)環(huán)維黃楊星D和蝙蝠葛堿進(jìn)行抑制作用評(píng)價(jià)。早期心臟毒性篩選時(shí)，判斷藥物對(duì)

7、HERG電流的抑制效應(yīng)一般采用尾電流峰值減小的程度。若尾電流的IC50小于30μM，提示藥物可能有導(dǎo)致心臟QT間期延長(zhǎng)的危險(xiǎn)，需進(jìn)一步進(jìn)行體內(nèi)試驗(yàn)研究。結(jié)果表明，環(huán)維黃楊星D能劑量依賴(lài)性的阻斷HERG電流，IC50為19.7μM，約5～6 min達(dá)到作用穩(wěn)態(tài)，洗脫后能部分恢復(fù)，提示對(duì)HERG通道的抑制可能是其延長(zhǎng)動(dòng)作電位時(shí)程致心律失常的作用機(jī)制之一。蝙蝠葛堿能劑量依賴(lài)性的阻斷HERG電流，IC50為3.5μM，抑制效應(yīng)表現(xiàn)迅速，1～3

8、min達(dá)到作用穩(wěn)態(tài)，洗脫后能部分恢復(fù)，由于蝙蝠葛堿對(duì)多種離子通道均有抑制作用，推測(cè)這些離子通道的綜合作用延長(zhǎng)心室復(fù)極時(shí)程，降低心肌興奮性，從而發(fā)揮抗心律失常的作用。
　　 進(jìn)而探討了環(huán)維黃楊星D和蝙蝠葛堿對(duì)HERG通道的作用機(jī)制。本試驗(yàn)設(shè)計(jì)了相應(yīng)的刺激程序，從電壓、時(shí)間、通道動(dòng)力學(xué)、通道穩(wěn)態(tài)、門(mén)控特性等方面觀察作用特點(diǎn)。結(jié)果表明，環(huán)維黃楊星D能抑制-10～+60 mV的部分步階電流和尾電流，能抑制-50～+20 mV的瞬時(shí)失活電

9、流，完全激活電流表明藥物對(duì)反轉(zhuǎn)電位無(wú)明顯影響。采用10 s去極化和“envelope of tails”刺激表明環(huán)維黃楊星D對(duì)電流的影響具有時(shí)間依賴(lài)性，在400～500 ms阻斷作用明顯增加，當(dāng)除極至+80 mV使通道失活時(shí)阻斷作用降低。提示環(huán)維黃楊星D主要作用于通道的開(kāi)放態(tài)。環(huán)維黃楊星D對(duì)通道激活、瞬時(shí)失活、復(fù)活和穩(wěn)態(tài)失活等動(dòng)力學(xué)無(wú)明顯影響。蝙蝠葛堿能抑制-10～+40 mV的步階電流和-10～+60 mV的尾電流，在+20～+60

10、mV的抑制程度高于-20～+10 mV，表明具有電壓依賴(lài)性。蝙蝠葛堿能抑制-50～+20 mV的瞬時(shí)失活電流，完全激活電流表明藥物能在-100～+20 mV減小電流，反轉(zhuǎn)電位從約-75 mV變?yōu)?65 mV，說(shuō)明影響了離子通道的選擇性。采用10 s去極化和“envelope of tails”刺激表明蝙蝠葛堿對(duì)電流的影響具有時(shí)間依賴(lài)性，在前4 s阻斷作用逐漸增加。蝙蝠葛堿能使激活曲線左移，半數(shù)激活電壓V1/2從-14.85±0.2 mV

11、變?yōu)?23.13±1.1 mV；使瞬時(shí)失活時(shí)間常數(shù)明顯減小，失活速度加快，-40 mV下，τ由14.1±0.7 ms變?yōu)?.1±0.5 ms；使復(fù)活時(shí)間常數(shù)明顯減小，復(fù)活速度加快，-50mV下，τ由10.1±0.5 ms變?yōu)?.1±0.5 ms。當(dāng)除極至+80 mV使通道失活時(shí)阻斷作用增加。這些結(jié)果提示蝙蝠葛堿能同時(shí)作用于開(kāi)放態(tài)和失活態(tài)。
　　 綜合研究結(jié)果，在本實(shí)驗(yàn)條件下，可以得到如下結(jié)論：①成功建立了藥物致QT間期延長(zhǎng)體外H

12、ERG通道評(píng)價(jià)模型，并從電生理和陽(yáng)性藥物兩方面驗(yàn)證了模型的可靠性。②環(huán)維黃楊星D和蝙蝠葛堿均能抑制HERG電流，提示兩藥均具有延長(zhǎng)心肌細(xì)胞動(dòng)作電位時(shí)程的作用。③環(huán)維黃楊星D對(duì)HERG電流的阻斷作用需要通道的激活，即主要作用于通道的開(kāi)放態(tài)。④蝙蝠葛堿對(duì)HERG電流的阻斷效應(yīng)表現(xiàn)迅速，能同時(shí)作用于通道的開(kāi)放態(tài)和失活態(tài)。⑤結(jié)合半數(shù)抑制濃度IC50和臨床用藥最高血藥濃度Cmax，環(huán)維黃楊星D在治療劑量下有很高的安全范圍，而蝙蝠葛堿在高劑量用藥或