縮短QT間期藥物潛在致心律失常風險及其標志物的研究.pdf

1、QT間期是指QRS波群起點至T波終點的時間間隔，代表心室除極開始至心室復極結(jié)束的時間間期，心室肌細胞膜上各種離子通道有序的開放和關(guān)閉是心臟正常電活動的基礎(chǔ)，動作電位形狀、時程取決于去極化和復極化離子流之間相互的精細平衡，Na+、Ca2+內(nèi)流使細胞膜去極化，各種外向K+電流使動作電位復極化，心室K+電流主要包括瞬時外向K+電流Ito、ATP敏感鉀電流IKATP,延遲整流K+電流及內(nèi)向整流K+電流IK1，延遲整流K+電流區(qū)分為快、慢兩種成分

2、IKr和IKs。先天遺傳基因改變或后天獲得性因素引起心肌離子通道結(jié)構(gòu)和/或功能紊亂，打破動作電位各種離子流之間的精細平衡，從而引起心肌復極延遲或加速，導致QT間期的延長或縮短是誘發(fā)心律失常產(chǎn)生的重要原因。
　　自上世紀發(fā)現(xiàn)抗心律失常藥奎尼丁能引起心臟復極化延遲，引發(fā)嚴重室性心律失常即尖端扭轉(zhuǎn)性室性心動過速（torsade de pointes,TdP）以來，臨床發(fā)現(xiàn)越來越多的藥物會通過阻斷復極過程中的外向K+電流，引起心臟復極化延

3、遲導致QT間期延長，復極化過程延遲易誘發(fā)早后除極（early after depolarization，EAD）觸發(fā)異常電興奮，加上復極離散度增大易發(fā)興奮折返，大大增加心臟發(fā)生室性心動過速的危險，最嚴重的后果是引發(fā)尖端扭轉(zhuǎn)性室性心動過速?；趯λ幬锎朔N潛在致命性威脅的認識，國際人用藥物協(xié)會（ICH）2004年發(fā)布技術(shù)指導原則，要求新藥研發(fā)過程中全面研究藥物對QT間期的影響，2014年后我國亦頒布了“藥物QT間期延長潛在作用非臨床研究技術(shù)

4、指導原則”，對新藥研發(fā)過程相關(guān)的非臨床安全評價做出了明確要求。近年通過對QT延長藥物致心律失常的大量研究，特別是借助于對遺傳性LQTs研究的認識，對該類藥物引發(fā)心律失常的分子、細胞機制基本達成共識。現(xiàn)行的QT延長藥物非臨床評價模式是以QT的延長作為風險標志物，然而大量的研究表明QT延長本身并不一定與TdP發(fā)生完全一致，需要用一些其它敏感、特異性標志物對藥物潛在風險高低做出評價?；谘娱LQT間期藥物致心律失常發(fā)生分子、細胞機制有人提出動作

5、電位三角形變（triangulation），反向頻率使用依賴性（reverse use dependence），QT短期不穩(wěn)定性（short-term instability）以及跨壁復極離散度（TDR）是藥物致心律失常較好的標志物。此外，尚有一些其它標志物如 QT/HR間期變異度、iCEB（QT/QRS）等。
　　與上述延長QT間期的藥物相反，有些藥物促進動作電位復極，具有縮短QT間期的作用。近幾年在離子通道藥物研究中發(fā)現(xiàn)了一些

6、鉀通道激動劑，已成功用于神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療。與此同時，作用于心肌細胞鉀通道的激動劑能夠縮短動作電位時程和QT間期，已經(jīng)報導多種小分子化合物可以特異性的作用于心肌細胞上的各種鉀通道，從而引起APD和QT間期縮短。在了解延長QT間期藥物致心律失常風險后，顯而易見的問題是縮短QT間期藥物是否也具有同樣的風險？近年臨床報道的遺傳性SQTs及其相關(guān)研究，使人們對此問題有了新的認識。2000年Gussak等人報導了一種以QT間期縮短并伴有惡性心率失

7、常為特征的遺傳性疾病，將其命名為short QT syndrome(SQTS)。SQTs在心電圖上主要表現(xiàn)為QT間期明顯縮短（QTc≤300 ms），常伴發(fā)心室顫動等惡性心率失常。
　　我們的前期實驗證實hERG通道激動劑ICA-105574具有一定的抗復極延遲所致心律失常作用，但同時能夠縮短QT間期和APD，可能具有潛在致心律失常作用，而IKs，IK1，IKATP等特異性鉀通道激動劑均有報道能夠縮短QT間期和APD，這些激動劑是

8、否具有潛在的致心律失常作用尚不明確。
　　另外，現(xiàn)行的“藥物QT間期延長潛在作用非臨床研究技術(shù)指導原則”以及前已述及的用于評價QT間期延長藥物潛在致心律失常發(fā)生風險的標志物是否適用于縮短QT間期藥物，目前尚無依據(jù)和法規(guī)支持。國際制藥行業(yè)亦無相關(guān)安全性評價的技術(shù)指導原則。因此，對于縮短QT間期藥物來講，建立一套評價其誘發(fā)心律失常的評價系統(tǒng)以及尋找能夠預測心律失常發(fā)生的生物標志物尤為重要。
　　本研究以不同鉀通道開放劑為工具藥，

9、擬通過Langendorff離體灌流心臟模型、標準玻璃微電極細胞內(nèi)記錄技術(shù)、動作電位鉗技術(shù)，從不同水平結(jié)合多種電生理技術(shù)，研究心臟不同靶點縮短QT藥物的致心律失常風險特征、探討致心律失常的細胞機制、并尋找致心律失常的風險標志物。研究將為創(chuàng)新藥物非臨床安全性評價提供新的參考，同時為解釋藥物致心律失常機制、臨床規(guī)避藥物風險提供實驗依據(jù)。
　　第一部分：豚鼠和兔離體心臟對縮短QT間期藥物敏感性比較
　　目的：
　　觀察豚鼠和

10、家兔離體心臟對不同縮短QT間期藥物的敏感性異同，并評估縮短QT間期藥物潛在致心律失常的風險和類型。
　　方法：
　　利用Langendorff離體心臟灌流技術(shù)，選擇不同類型的鉀通道開放劑：hERG通道開放劑ICA-105574和NS-1643，IKs開放劑R-L3，ATP敏感鉀通道開放劑吡那地爾（Pinacidil）。觀察心電圖（ECG）各參數(shù)的變化，并比較豚鼠和家兔心律失常發(fā)生率的異同。實驗程序如下：為觀察不同濃度鉀通道開

11、放劑對心電圖各參數(shù)的影響，首先心臟穩(wěn)定一小時以保證記錄到穩(wěn)定可靠的心電圖；以含0.1％DMSO的臺氏液作為對照溶液灌流心臟30分鐘，再按照低、中、高的濃度順序依次灌流鉀通道開放劑，觀察鉀通道開放劑對兩種不同動物種屬的致心律失常發(fā)生風險和類型。
　　結(jié)果：
　　1.hERG通道開放劑：ICA-105574可濃度依賴性縮短豚鼠QT間期，在高濃度（10μM）縮短程度可達50%以上（n=8，P<0.01），并且引起顯著的T波倒置，隨

12、之伴發(fā)non-TdP-like VT/VF樣心律失常，心律失常發(fā)生率達62.5%（n=8）。與之相比，ICA-105574同樣濃度依賴性的縮短家兔離體心臟QT間期，在10μM對QT間期的縮短程度達46%（n=6，P<0.01），可引起T波倒置并誘發(fā)心律失常，發(fā)生率為50%（n=6）。NS-1643是作用機制不同于ICA-105574的另外一種hERG通道開放劑，同樣可以濃度依賴性的縮短豚鼠和家兔的QT間期，高濃度時其縮短程度分別可達20

13、%（n=5，P<0.01）和15%（n=5，P<0.05）。值得注意的是在豚鼠心臟模型中心律失常發(fā)生率為60%（n=5），在兔離體模型中未見心律失常的發(fā)生。
　　2.IKs開放劑：R-L3相比較于上述兩種hERG通道開放劑，對QT間期的縮短程度明顯低于二者。高濃度時在豚鼠和兔心臟模型僅縮短15%和7%（n=5），同時可誘發(fā)VT/VF，豚鼠心律失常發(fā)生率為40%（n=5），在兔離體模型中未見心律失常的發(fā)生。
　　3.ATP敏感

14、鉀通道開放劑：吡那地爾（Pinacidil）濃度依賴性的縮短豚鼠（n=7）和兔離體心臟QT間期（n=6），30μM Pinacidil在7例豚鼠心臟中誘發(fā)了4例產(chǎn)生心律失常，而兔離體心臟中未見有心律失常發(fā)生。
　　小結(jié)：
　　四種鉀通道開放劑可顯著縮短豚鼠離體心臟QT間期，并誘發(fā)VT/VF；對于兔離體心臟模型而言，只有ICA-105574在高濃度時可誘發(fā)VT/VF，其余三種鉀通道開放劑并未誘發(fā)心律失常。相比較于兔心臟模型，豚

15、鼠心臟模型對鉀通道開放劑更為敏感，可作為評估縮短QT間期藥物潛在致心律失常風險的動物模型。
　　第二部分：縮短QT間期藥物對豚鼠離體心電圖各參數(shù)的影響
　　目的：
　　觀察縮短QT間期藥物對豚鼠離體心電圖各參數(shù)的影響，并尋找預測心律失常發(fā)生的生物標志物。
　　方法：
　　1.利用Langendorff離體心臟灌流技術(shù)，將兩個電極置于離體心臟的主動脈根部和心尖部，通過BIOPAC/MP150多道生理測定系統(tǒng)記

16、錄給予不同濃度縮短QT間期藥物后心電圖（ECG）的變化，并采用受試者工作曲線對心電圖各參數(shù)進行分析，尋找預測心律失常發(fā)生敏感性和特異性較高的生物標志物。實驗程序如下：為觀察不同濃度縮短QT間期藥物對心電圖各參數(shù)的影響，首先心臟穩(wěn)定一小時以保證記錄到穩(wěn)定可靠的心電圖；以含0.1%DMSO的臺氏液作為對照溶液灌流心臟30分鐘，再按照低、中、高的濃度順序依次灌流縮短QT間期藥物，觀察給予縮短QT間期藥物前后心電圖各參數(shù)的變化。
　　2.

17、受試者工作曲線（ROC curve）是臨床診斷常用的一種分析方法，可用于兩種或兩種以上不同診斷試驗對疾病識別能力的比較。在對同一種疾病的兩種或兩種以上診斷方法進行比較時，可將各個診斷結(jié)果的ROC曲線繪制到同一坐標中，以直觀的鑒別其診斷價值的高低，靠近左上角的ROC曲線所代表的診斷價值最準確。也可以通過分別計算各個指標的ROC曲線下的面積（AUC）進行比較，曲線下面積（AUC）越大的參數(shù)代表其診斷的準確性越高，一般來說AUC>0.9說明該

18、參數(shù)具有較高準確性、AUC在0.7-0.9時有一定的準確性、AUC在0.5-0.7時有較低的準確性。
　　結(jié)果：
　　1.hERG通道開放劑：ICA-105574濃度依賴性的顯著縮短QT間期、JTpeak間期（代表早期復極時程）、iCEB（QT/QRS的比值）。同時ICA-105574濃度依賴性的增大JT area（代表跨壁復極離散度）。ICA-105574在高濃度（10μM）時QT間期變異度和心率變異度顯著增加，8例豚鼠心

19、臟中有5例發(fā)生了心律失常。采用受試者工作曲線分析以上ECG各參數(shù)，結(jié)果顯示JTpeak間期、JT area、Tp-e等三個參數(shù)的曲線下面積大于0.9，提示上述三個參數(shù)預測ICA-105574誘發(fā)心律失常的準確度更高。NS-1643在三個測試濃度中均可以濃度依賴性的縮短QT間期和JTpeak間期，在高濃度時（10μM）顯著降低iCEB。同ICA-105574一樣，NS-1643濃度依賴性的增大JT area。在給予10μM的NS-1643

20、后，5例心臟中3例出現(xiàn)VT或VF，值得注意的是僅在高濃度時PR間期顯著延長，提示NS-1643對房室傳導可能有一定的阻滯作用。采用受試者工作曲線分析以上ECG各參數(shù)，結(jié)果顯示JTpeak間期、JT area、心率變異度等三個參數(shù)的曲線下面積大于0.9，提示上述三個參數(shù)預測NS-1643誘發(fā)心律失常的準確度更高。
　　2.IKs開放劑：R-L3濃度依賴性的縮短QT間期和JTpeak間期，與NS-1643相似，R-L3只在高濃度（10

21、μM）時降低iCEB。除此之外， JT area隨濃度增加而增大，最高可增大至對照的四倍。高濃度R-L3誘發(fā)VT/VF的發(fā)生率為40%。受試者工作曲線分析以上ECG各參數(shù)，結(jié)果顯示JTpeak間期、JT area兩個參數(shù)的曲線下面積大于0.9，提示二者預測R-L3誘發(fā)心律失常的準確度更高。
　　3.ATP敏感鉀通道開放劑：給予不同濃度的Pinacidil后QT間期、JTpeak間期、iCEB均呈濃度依賴性的縮短或降低。與此同時，T

22、p-e和JT area顯著升高。給予20μM的Pinacidil后，7例心臟中的4例發(fā)生心律失常。受試者工作曲線分析顯示，JTpeak間期、JT area兩個參數(shù)的曲線下面積大于0.9，提示二者預測Pinacidil誘發(fā)心律失常的準確度更高。
　　小結(jié)：
　　四種不同類型的鉀通道開放劑可不同程度的影響豚鼠離體心電圖各參數(shù)，ROC曲線分析顯示，JTpeak間期的縮短和JT area的增大在能較準確預測鉀通道開放劑潛在致心律失常

23、風險。同時，結(jié)果提示，加速早期復極和跨壁復極離散度的增大可能是鉀通道開放劑誘發(fā)心律失常的主要機制。
　　第三部分：縮短QT間期藥物對豚鼠乳頭肌動作電位和電流的影響
　　目的：
　　觀察縮短QT間期藥物對豚鼠乳頭肌動作電位各參數(shù)的影響，并探討其致心律失常的發(fā)生機制。
　　方法：
　　1.采用標準玻璃微電極細胞內(nèi)記錄技術(shù)，記錄豚鼠乳頭肌動作電位，觀察在不同刺激頻率下（0.2 Hz、1 Hz、2 Hz）給予不同濃

24、度鉀通道開放劑后，動作電位復極化30%時間（APD30，代表動作電位早期復極參數(shù)）、動作電位復極化90%時間（APD90）、APD90-30（反映復極中晚期時程）和有效不應期（ERP）以及對豚鼠心肌細胞動作電位頻率依賴性的影響。并觀察觸發(fā)活動（早后除極或遲后除極）的發(fā)生情況，采用受試者工作曲線對給予縮短QT間期藥物前后動作電位各參數(shù)進行分析，尋找在動作電位水平能預測觸發(fā)活動發(fā)生的標志物。
　　2.在急性分離的心肌細胞上，利用動作電

25、位鉗技術(shù)，觀察四種縮短QT間期藥物對心肌細胞復極過程中外向電流的影響。首先，在豚鼠心室肌細胞上，電流鉗模式下記錄動作電位，以此記錄到的動作電位波形作為刺激protocol記錄復極過程中外向鉀電流的變化。記錄外向電流的溶液：電極內(nèi)液（mmol/L）：KCl140，Mg-ATP4，MgCl21，EGTA5，HEPES10，用KOH調(diào)pH至7.2。電極外液（mmol/L）：NMG130，KCl5.4，MgCl21，CaCl22，glucose

26、10，HEPES10用NaOH調(diào)pH至7.4。CdCl2（300μM）加入到外液中阻斷鈣電流。
　　3.在急性分離的心肌細胞上，利用動作電位鉗技術(shù)，觀察四種縮短QT間期藥物對心肌細胞復極過程中內(nèi)向電流的影響。單個室性動作電位波刺激誘發(fā)內(nèi)向電流。記錄內(nèi)向電流的溶液：電極內(nèi)液（mmol/L）：CsOH70,aspartic acid80,CsCl40,NaCl10,MgCl22,HEPES10,EGTA10,MgATP5, Na2GT

27、P0.2, Na2-phosphocreatine4,用CsOH調(diào)pH至7.2。電極外液（mmol/L）：NaCl130，CsCl5.4，MgCl21，CaCl22，glucose10，HEPES10用NaOH調(diào)pH至7.4。
　　結(jié)果：
　　1.首先，我們考察了四種鉀通道開放劑對動作電位反向使用頻率依賴性的影響，結(jié)果顯示：在高中低三個濃度，均不影響動作電位的頻率依賴性。
　　2.動作電位各參數(shù)的變化：為了更直觀的觀察

28、鉀通道開放劑作用于心肌復極過程中哪一時期，我們對復極時程進行分段考量即：APD30和APD90-30。在2Hz刺激頻率下，四種鉀通道開放劑均可濃度依賴性的縮短APD90、APD30和有效不應期（ERP），除高濃度Pinacidil外，另外三種鉀通道開放劑對APD90-30均無顯著影響。
　　3.EAD或DAD發(fā)生率：我們考察了在三個刺激頻率0.2 Hz、1 Hz、2 Hz刺激下觸發(fā)活動的發(fā)生情況，結(jié)果顯示：在0.2Hz和1Hz刺激

29、下未見EAD或DAD發(fā)生；在2Hz刺激下，除Pinacidil外，其余三種鉀通道開放劑在高濃度時均誘發(fā) EAD或 DAD的發(fā)生。其中，給予10μM ICA-105574后，6例標本中4例出現(xiàn)EAD現(xiàn)象，而且EAD發(fā)生在復極早期階段；10μM NS-1643可誘發(fā)5例標本中4例出現(xiàn)DAD；IKs開放劑 R-L3誘發(fā) DAD的發(fā)生率高達100%，5例標本在2Hz刺激條件下全部發(fā)生DAD。
　　4.受試者工作曲線分析動作電位各參數(shù)：對以

30、上各動作電位參數(shù)進行分析，結(jié)果顯示：APD90和APD30兩個參數(shù)的曲線下面積大于0.9，提示，二者預測ICA-105574、NS-1643和R-L3誘發(fā)EAD/DAD的準確度更高。值得注意的是，三種鉀通道開放劑的APD90和APD30兩個參數(shù)曲線下面積完全相同即二者預測能力完全相同，提示我們，APD90的縮短可能來自于APD30的貢獻更多。
　　5.四種鉀通道開放劑對復極過程中外向鉀電流的影響：四種鉀通道開放劑均可濃度依賴性的增

31、加早期復極過程外向電流的幅度，然而增加的方式卻不盡相同，ICA-105574對電流的增加主要集中在APD30時程下，呈現(xiàn)“穹頂”式增加；NS-1643則是“爬坡”式增加外向電流；IKs開放劑R-L3對外向電流的增大方式與ICA-15574相似，但是增幅要小于ICA-105574；Pinacidil均勻增加整個復極過程中外向電流的幅值，這也可能是其未誘發(fā) EAD或 DAD的原因所在。接下來我們又在急性分離的豚鼠心室肌細胞上驗證了鉀通道開放