兔左心室動(dòng)脈灌流楔形標(biāo)本在藥物潛在致心律失常風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)中的應(yīng)用.pdf

1、自上世紀(jì)50年代發(fā)現(xiàn)抗心律失常藥奎尼丁能引起心臟復(fù)極化延遲,引發(fā)嚴(yán)重室性心律失常即尖端扭轉(zhuǎn)性室性心動(dòng)過(guò)速(torsade de pointes,TdP)以來(lái),臨床越來(lái)越多的發(fā)現(xiàn)藥物引發(fā)TdP造成心源性暈厥、甚至猝死的報(bào)道。業(yè)已發(fā)現(xiàn),能夠引發(fā)TdP的藥物涉及各個(gè)系統(tǒng)治療藥物,除延遲復(fù)極的抗心律失常藥外,常見(jiàn)藥物包括抗組胺藥、抗精神失常藥、抗菌藥、抗腫瘤藥及心血管系統(tǒng)藥物等。這些藥物盡管結(jié)構(gòu)各異,但共同的作用是抑制心肌細(xì)胞復(fù)極化中起關(guān)鍵作用

2、的一種延遲整流鉀通道(該通道的孔區(qū)由human ether-a-go-go related gene編碼,簡(jiǎn)稱(chēng)HERG通道),延長(zhǎng)心臟復(fù)極過(guò)程,心電圖上表現(xiàn)QT間期的延長(zhǎng)。QT間期延長(zhǎng)致復(fù)極離散度增大,大大增加心臟發(fā)生室性心動(dòng)過(guò)速的危險(xiǎn)。特非那定、阿司咪唑、西沙必利、米貝拉地爾及格帕沙星等藥因引發(fā)TdP被相繼撤出市場(chǎng)?；谒幬锎朔N潛在致命性威脅的認(rèn)識(shí),人用藥品注冊(cè)技術(shù)要求國(guó)際協(xié)調(diào)會(huì)(ICH)于2002年11月專(zhuān)門(mén)發(fā)布了“人用藥品延遲心室

3、復(fù)極化(QT間期延長(zhǎng))潛在致心律失常作用的非臨床安全評(píng)價(jià)”指導(dǎo)原則的討論稿,經(jīng)廣泛征求意見(jiàn)后于2005年5月形成了最后稿,作為國(guó)際新藥安全藥理研究的補(bǔ)充指導(dǎo)原則(S7B)于2005年12月正式啟用。
　　 S7B指導(dǎo)原則要求對(duì)QT間期延長(zhǎng)藥物的非臨床安全性評(píng)價(jià)包括以下4個(gè)不同功能水平的研究:1)采用離體動(dòng)物或人體心臟細(xì)胞、培養(yǎng)心臟細(xì)胞系或克隆人離子通道的異種表達(dá)體系評(píng)價(jià)對(duì)HERG離子流的影響。2)在離體心臟標(biāo)本進(jìn)行動(dòng)作電位參數(shù)測(cè)

4、定,或在麻醉動(dòng)物中進(jìn)行能體現(xiàn)動(dòng)作電位周期的特異性電生理參數(shù)檢測(cè)。3)測(cè)定清醒或麻醉動(dòng)物的ECG參數(shù)。4)在離體心臟標(biāo)本或動(dòng)物進(jìn)行致心律失常作用測(cè)定。其中前三項(xiàng)包括HERG電流、動(dòng)作電位復(fù)極參數(shù)以及整體動(dòng)物心電圖QT間期的評(píng)價(jià)均為通過(guò)延遲復(fù)極指標(biāo)或參數(shù)間接判斷藥物引發(fā)心律失常的潛在危險(xiǎn)。然而,由于藥物延遲復(fù)極程度與致心律失常危險(xiǎn)性高低之間的關(guān)系尚未確立,近幾年,建立離體或整體敏感心律失常動(dòng)物模型成為研究熱點(diǎn)。因藥物誘發(fā)TdP常常是在病理情

5、況下,特別是心肌復(fù)極儲(chǔ)備降低的心臟(如遺傳性LQTs、心肌肥厚或心衰等),常規(guī)正常動(dòng)物心臟模型難以觀察到QT延長(zhǎng)藥物的致心律失常作用,有研究顯示甲氧胺敏化兔模型以及慢性房室阻斷犬模型可提高評(píng)價(jià)的敏感性,此外,已報(bào)道的心律失常動(dòng)物模型有離體動(dòng)脈灌流左室楔形標(biāo)本及Langendorff灌流兔心。在上述報(bào)道的四種模型中,動(dòng)脈灌流左心室楔形標(biāo)本具有較高的敏感性和特異性,而被越來(lái)越多地采用,該模型還對(duì)于理解心電圖復(fù)極波的細(xì)胞基礎(chǔ)及心律失常發(fā)生機(jī)制

6、具有重要幫助。
　　 目前,我國(guó)對(duì)藥物致心律失常危險(xiǎn)性的認(rèn)識(shí)處于起步階段,尚未建立完善的的技術(shù)評(píng)價(jià)體系,尤其是缺乏敏感心律失常模型。
　　 本實(shí)驗(yàn)擬建立冠狀動(dòng)脈灌流兔左心室楔形組織模型,即制作兔左心室游離壁楔形標(biāo)本,經(jīng)冠狀動(dòng)脈左回旋支灌流臺(tái)式液,采用浮置玻璃微電極同步記錄心內(nèi)膜、心外膜下心肌細(xì)胞動(dòng)作電位及跨室壁心電圖,并利用此方法評(píng)價(jià)阿霉素的急性心臟毒性。該心律失常模型的建立將作為“QT延遲藥物潛在致心律失常危險(xiǎn)性”評(píng)價(jià)

7、技術(shù)體系的一部分,用于新藥,特別是創(chuàng)新藥物非臨床安全性評(píng)價(jià)?？稍谛滤幯邪l(fā)過(guò)程中及早發(fā)現(xiàn)新藥潛在的致命性不良反應(yīng),從而做到合理評(píng)估藥物的研發(fā)前景,對(duì)降低創(chuàng)新藥物研發(fā)風(fēng)險(xiǎn)及預(yù)測(cè)藥物嚴(yán)重不良反應(yīng)、保障人民生命安全均具有十分重要的意義。
　　 一、兔左心室動(dòng)脈灌流楔形模型的建立
　　 目的:建立穩(wěn)定、敏感的兔左心室動(dòng)脈灌流楔形組織模型
　　 方法:3～4個(gè)月齡新西蘭雌性白兔,體重2.0～2.5kg,耳緣靜脈注射肝素(20

8、0 IU/kg)抗凝、戊巴比妥鈉(30～35 mg/kg)麻醉后,迅速開(kāi)胸取出心臟。先以低溫停跳液(KCl為24mmol/L、不含Ca2+的臺(tái)氏液)從主動(dòng)脈逆行灌流,將自制灌流針經(jīng)主動(dòng)脈左竇開(kāi)口處插入冠狀動(dòng)脈左側(cè)回旋支,制成以回旋支為中心軸,長(zhǎng)約10～20 mm、寬約5～10 mm、厚約3～3.5 mm的心室肌楔型組織塊。將組織塊固定于恒溫浴槽中,持續(xù)灌流充以純氧的正常臺(tái)氏液,溫度35.7±0.1℃,灌流速度為3～4ml/min。臺(tái)式液

9、組成(mmol/L):NaCl140、KCl5.4、MgCl21.0、CaCl22.0、HEPS10、葡萄糖10(pH7.35～7.45)。
　　 微電極拉制器制備記錄玻璃微電極,使其內(nèi)充3 mol/L KCI時(shí)的電極電阻為10～20MΩ。玻璃微電極與懸浮鉑金絲電極相連,經(jīng)微電極放大器、多道生理信號(hào)采集系統(tǒng)進(jìn)行信號(hào)轉(zhuǎn)化、記錄。以1～2mm的間隔從外膜向內(nèi)膜側(cè)心肌的動(dòng)作電位(APD)進(jìn)行記錄,觀察跨壁各層的動(dòng)作電位時(shí)程特點(diǎn),以確定

10、內(nèi)、外膜下心肌記錄部位。
　　 將兩根玻璃微電極扎入同一平面內(nèi)、外膜心肌細(xì)胞,同時(shí)在相同平面距離心室組織塊內(nèi)、外膜側(cè)距離分別約為1.0～1.5 cm處放置電極記錄楔狀組織塊跨壁心電圖(ECG)。獲得穩(wěn)定的內(nèi)、外膜側(cè)心肌細(xì)胞APD、跨壁ECG同步記錄。為驗(yàn)證系統(tǒng)敏感性,分別記錄延長(zhǎng)復(fù)極但不引發(fā)TdP的胺碘酮(100μmol/L,)、延長(zhǎng)復(fù)極且引發(fā)TdP的莫西沙星(100μmol/L)給藥前及給藥后30min1Hz頻率刺激下APD、

11、ECG。計(jì)算以下參數(shù):APD90(動(dòng)作電位復(fù)極90％需要時(shí)間)、跨壁復(fù)極離散度(TDR)=內(nèi)膜下細(xì)胞APD90-外膜下細(xì)胞APD90、QT間期(為QRS復(fù)合波的起點(diǎn)到T波降支終點(diǎn)之間的時(shí)程)、Tp-e間期(為T(mén)波的峰值與T波終點(diǎn)之間的時(shí)程,一般認(rèn)為該時(shí)程間接反映跨壁TDR)。同時(shí)觀察藥物是否引發(fā)早后除極(EAD)。
　　 結(jié)果:(1)在動(dòng)脈灌流組織塊標(biāo)本上,從心外膜側(cè)到內(nèi)膜側(cè)心肌細(xì)胞APD呈逐漸延長(zhǎng)趨勢(shì),除在兩例標(biāo)本的中間層細(xì)胞

12、上偶記錄到平臺(tái)期明顯較內(nèi)、外膜層長(zhǎng)的APD外,未發(fā)現(xiàn)明顯的M細(xì)胞層。故心內(nèi)、外膜細(xì)胞APD同步記錄時(shí)選擇內(nèi)、外各約1/3側(cè)肌層細(xì)胞。(2)取得心內(nèi)、外膜細(xì)胞APD、跨壁ECG同步記錄后,分別在0min、30min、60min、90min、120min給予1Hz刺激,APD90、QT間期在2h內(nèi)無(wú)明顯改變,表明獲得了穩(wěn)定的組織塊灌流標(biāo)本。(3)標(biāo)本穩(wěn)定1～1.5小時(shí)后,灌流液中分別加入胺碘酮(100μmol/L)、莫西沙星(100μmol

13、/L)。結(jié)果顯示胺碘酮延長(zhǎng)外膜層心肌APD90(由藥前的277±12延長(zhǎng)至365±16,p＜0.05),同時(shí)亦延長(zhǎng)內(nèi)膜層心肌APDgo(由藥前的329±22延長(zhǎng)至406±19,p＜0.05),但由于外膜的延長(zhǎng)幅度大于內(nèi)膜,TDR明顯減小(由對(duì)照的52±13減小到40±11,p＜0.05),QT間期明顯延長(zhǎng)(由藥前的395±14延長(zhǎng)至460±17,p＜0.05),Tp-e間期明顯減小(由對(duì)照的67±12減小到53±14,p＜0.05)。所

14、有記錄標(biāo)本上均未發(fā)現(xiàn)EAD。莫西沙星可顯著延長(zhǎng)外膜層心肌APD90(由藥前的287±17延長(zhǎng)至335±21,p＜0.05),同時(shí)亦延長(zhǎng)內(nèi)膜層心肌APD90(由藥前的335±13延長(zhǎng)至529±18,p＜0.05),其中內(nèi)膜延長(zhǎng)幅度遠(yuǎn)大于外膜的延長(zhǎng)幅度,TDR明顯增大(由對(duì)照的48±10增大到195±33,p＜0.05),QT間期顯著延長(zhǎng)(由藥前的365±20延長(zhǎng)至547±23,p＜0.05),Tp-e間期顯著增大(由對(duì)照的62±14增加到

15、22±23,p＜0.05),在六例標(biāo)本中有四例出現(xiàn)EAD。
　　 結(jié)論:本實(shí)驗(yàn)建立了穩(wěn)定的兔左心室動(dòng)脈灌流楔形組織模型,此模型可同步記錄心內(nèi)、外膜下心肌細(xì)胞動(dòng)作電位及跨壁組織塊心電圖。利用延長(zhǎng)復(fù)極但不引發(fā)TdP的胺碘酮和延長(zhǎng)復(fù)極且引發(fā)TdP的莫西沙星驗(yàn)證了系統(tǒng)各電生理指標(biāo)的敏感性。該模型可用于QT延遲藥物潛在致心律失常危險(xiǎn)性的評(píng)價(jià)。
　　 二、利用兔左心室動(dòng)脈灌流楔形模型評(píng)價(jià)阿霉素的急性心臟毒性
　　 目的:評(píng)價(jià)

16、阿霉素急性應(yīng)用的潛在致心律失常危險(xiǎn)性
　　 方法:參照第一部分實(shí)驗(yàn)方法制備穩(wěn)定的兔左心室動(dòng)脈灌流楔形組織標(biāo)本,分別在1Hz、0.5Hz刺激頻率下,記錄阿霉素(100μmol/L)給藥前及給藥后20min、40min、60min APD及ECG。計(jì)算以下參數(shù):APD90(動(dòng)作電位復(fù)極90％需要時(shí)間)、跨壁復(fù)極離散度(TDR)=內(nèi)膜下細(xì)胞APD90-外膜下細(xì)胞APD90、QT間期(為QRS復(fù)合波的起點(diǎn)到T波降支終點(diǎn)之間的時(shí)程)、Tp

17、-e間期(為T(mén)波的峰值與T波終點(diǎn)之間的時(shí)程,一般認(rèn)為該時(shí)程間接反映跨壁TDR),同時(shí)觀察藥物是否引發(fā)早后除極(EAD)。
　　 結(jié)果:取得心內(nèi)、外膜細(xì)胞APD、跨壁ECG同步記錄后,灌流液中加入阿霉素,在1Hz和0.5Hz頻率刺激下,灌流前和灌流20min、40min、60min后相比較,左心室壁內(nèi)、外膜動(dòng)作電位時(shí)程(APD)、TDR、QT間期、Tp-e間期均無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。結(jié)果顯示,在1Hz刺激頻率下,阿霉素在一

18、小時(shí)內(nèi)對(duì)外膜層心肌APD90無(wú)明顯作用(給藥前后變化分別為362±12、366±25、365±23、361±13,P＞0.05),對(duì)心內(nèi)膜亦無(wú)明顯作用(給藥前后變化分別為402±22、405±27、405±17、398±21,P＞0.05),TDR無(wú)明顯變化(給藥前后分別為42±9、40±12、41±11、38±16,P＞0.05),QT間期無(wú)明顯變化(給藥前后分別為419±25、416±22、420±12、418±13,P＞0.05)

19、,Tp-e間期無(wú)明顯變化(給藥前后分別為61±13、60±10、63±15、60±11,P＞0.05)。在0.5Hz刺激頻率下,阿霉素在一小時(shí)內(nèi)對(duì)外膜層心肌APD90亦無(wú)明顯作用(給藥前后變化分別為360±16、364±13、365±11、361±20,P＞0.05),對(duì)心內(nèi)膜亦無(wú)明顯作用(給藥前后變化分別為401±11、405±17、407±12、397±24,P＞0.05),TDR無(wú)明顯變化(給藥前后分別為41±15、40±10、4