藥物-化合物多系統(tǒng)體外急性毒性初步評(píng)價(jià)模型的建立.pdf

1、藥物開發(fā)過(guò)程中，90％遭淘汰的候選藥物中有50％是因?yàn)槎拘栽蚨馓蕴?。為保障人類健康，企業(yè)或機(jī)構(gòu)需要評(píng)估新化合物的毒性，這種安全性評(píng)價(jià)通常是基于動(dòng)物毒理實(shí)驗(yàn)。以體外方法替代體內(nèi)方法可以在篩選化合物同時(shí)，預(yù)測(cè)化合物急性口服毒性，由此加速藥物開發(fā)。體外毒性測(cè)試方法有快速、廉價(jià)、實(shí)驗(yàn)條件可控、結(jié)果易于定量等諸多優(yōu)點(diǎn)。在制藥工業(yè)中引進(jìn)中、高通量體外篩選，可以大量減少動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和分析大量合成化合物的成本。因此，藥物研發(fā)部門需要在開發(fā)早期以中、高通

2、量體外檢測(cè)方法（且只需相對(duì)微量的化合物就可檢測(cè)毒性）檢測(cè)化合物毒性，如細(xì)胞毒性測(cè)試或靶向毒性測(cè)試。 目的: 本論文以原代分離培養(yǎng)的大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元以及大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤PC12細(xì)胞為神經(jīng)毒性細(xì)胞模型；原代大鼠心肌細(xì)胞和大鼠傳代心肌細(xì)胞H9c2為心肌毒性細(xì)胞模型；人正常胎肝細(xì)胞L-O2細(xì)胞、人肝癌HepG2和BEL-7402細(xì)胞等三種人源性肝細(xì)胞株作為肝毒性細(xì)胞模型，用以評(píng)價(jià)藥物或化合物對(duì)神經(jīng)、心肌與肝臟的急性毒性，經(jīng)過(guò)與動(dòng)物體內(nèi)

3、急性毒性（LD50）等指標(biāo)對(duì)比、分析確認(rèn)體內(nèi)外安全性評(píng)價(jià)體系的相關(guān)性，以及是否可以部分或者完全替代動(dòng)物毒理實(shí)驗(yàn)，為建立穩(wěn)定的體外高通量篩選化合物和藥物的急性毒性評(píng)價(jià)體系奠定基礎(chǔ)。 方法: （1）藥物/化合物神經(jīng)毒性實(shí)驗(yàn):細(xì)胞的分離和培養(yǎng)原代分離24h內(nèi)新生SD大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元，培養(yǎng)在預(yù)先鋪好多聚賴氨酸的96孔板，至7-10d細(xì)胞狀態(tài)最佳時(shí)用于實(shí)驗(yàn)；傳代PC12細(xì)胞以5×105密度種96孔板，37℃、5％CO2、100％濕度

4、常規(guī)培養(yǎng)24h，用于實(shí)驗(yàn)。取17種藥物和化合物（具一定神經(jīng)毒性），分別與原代神經(jīng)元和PC12細(xì)胞于CO2培養(yǎng)箱孵育24h，設(shè)立不同濃度組與空白對(duì)照組，觀察細(xì)胞形態(tài)變化；以MTT法檢測(cè)藥物/化合物對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制率，據(jù)此量效曲線計(jì)算出IC50，與大鼠口服LD50進(jìn)行相關(guān)性分析。 （2）藥物/化合物心臟毒性實(shí)驗(yàn)原代分離24h內(nèi)新生SD大鼠心肌細(xì)胞，培養(yǎng)在96孔板，4-7d細(xì)胞狀態(tài)最佳時(shí)用于實(shí)驗(yàn)；傳代H9c2細(xì)胞以1×105密度種96

5、孔板，常規(guī)培養(yǎng)24h，用于實(shí)驗(yàn)。取20種藥物和化合物（具一定心臟毒性）分別與原代大鼠心肌細(xì)胞和大鼠心肌細(xì)胞H9c2于CO2培養(yǎng)箱孵育24h，設(shè)立不同濃度組與空白對(duì)照組，觀察細(xì)胞形態(tài)變化以及心肌搏動(dòng)頻率變化；以MTT法檢測(cè)藥物/化合物對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制率，據(jù)此量效曲線計(jì)算出IC50，與大鼠口服LD50進(jìn)行相關(guān)性分析。 （3）藥物/化合物肝臟毒性實(shí)驗(yàn)人肝癌細(xì)胞HepG2、人肝細(xì)胞癌BEL-7402細(xì)胞、人正常胎肝細(xì)胞LO-2細(xì)胞三種人

6、源肝細(xì)胞株以1×105密度種96孔板，常規(guī)培養(yǎng)24h，用于實(shí)驗(yàn)。取21種藥物和化合物（具一定肝毒性）分別與三種人源肝細(xì)胞（人肝癌細(xì)胞HepG2、人肝細(xì)胞癌BEL-7402細(xì)胞、人正常胎肝細(xì)胞L-O2細(xì)胞）于CO2培養(yǎng)箱孵育24h，設(shè)立不同濃度組與空白對(duì)照組，觀察細(xì)胞形態(tài)變化；以MTT法檢測(cè)藥物/化合物對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制率，據(jù)此量效曲線計(jì)算出IC50，與大鼠口服LD50進(jìn)行相關(guān)性分析。 結(jié)果: （1）原代大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元的IC

7、50與動(dòng)物體內(nèi)LD50相關(guān)性為：R2=0.77，PC12細(xì)胞毒性檢測(cè)結(jié)果的IC50與動(dòng)物體內(nèi)急性毒性LD50相關(guān)性為：R2=0.64，有明顯相關(guān)性。以17種化合物每次實(shí)驗(yàn)所得IC50值的平均值與已知的大鼠口服LD50（來(lái)源于化學(xué)品安全數(shù)據(jù)庫(kù)）進(jìn)行回歸得到了回歸公式：lg（LD50）（mg/kg）=0.4575lg（IC50）(mg/ml)+3.2826（大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元），lg（LD50）（mg/kg）=0.4715lg（IC50）(mg

8、/ml)+3.1721（PC12）。在此公式中代入實(shí)驗(yàn)得到的IC50值可以預(yù)測(cè)大鼠口服LD50值。 （2）原代大鼠心肌細(xì)胞的IC50與體內(nèi)LD50相關(guān)性為：R2=0.76，大鼠心肌細(xì)胞H9c2細(xì)胞毒性檢測(cè)結(jié)果的IC50與動(dòng)物體內(nèi)急性毒性LD50相關(guān)性為：R2=0.67，有明顯相關(guān)性；以20種化合物每次實(shí)驗(yàn)所得IC50值的平均值與已知的大鼠口服LD50（來(lái)源于化學(xué)品安全數(shù)據(jù)庫(kù)）進(jìn)行回歸得到了回歸公式：lg（LD50）（mg/kg）

9、=0.5177lg（IC50）(mg/ml)+3.1602（大鼠心肌細(xì)胞），lg（LD50）（mg/kg）=0.4362lg（IC50）(mg/ml)+3.2283（H9c2）。在此公式中代入實(shí)驗(yàn)得到的IC50值可以預(yù)測(cè)大鼠口服LD50值。隨藥物或化合物濃度升高，細(xì)胞形態(tài)改變，心肌搏動(dòng)異常乃至停搏。 （3）體外HepG-2的IC50與體內(nèi)LD50相關(guān)性為：R2=0.81，L-O2細(xì)胞毒性檢測(cè)結(jié)果的IC50與動(dòng)物體內(nèi)急性毒性LD5

10、0相關(guān)性為：R2=0.81，BEL-7402細(xì)胞毒性檢測(cè)結(jié)果的IC50與動(dòng)物體內(nèi)急性毒性LD50相關(guān)性為：R2=0.60，有明顯相關(guān)性。以21種化合物每次實(shí)驗(yàn)所得IC50值的平均值與已知的大鼠口服LD50（來(lái)源于化學(xué)品安全數(shù)據(jù)庫(kù)）進(jìn)行回歸得到了回歸公式：lg（LD50）（mg/kg）=0.569 lg（IC50）(mg/ml)+3.3062（HepG2），lg（LD50）（mg/kg）=0.5332lg（IC50）(mg/ml)+3.2

11、913（L-O2）；lg（LD50）（mg/kg）=0.5462lg（IC50）(mg/ml)+3.1746（BEL-7402）。在此公式中代入實(shí)驗(yàn)得到的IC50值可以預(yù)測(cè)大鼠口服LD50值。 結(jié)論: 利用體外分離培養(yǎng)的原代神經(jīng)元、心肌細(xì)胞以及正常肝臟細(xì)胞可以在體外評(píng)價(jià)受試化合物、藥物的急性毒性，與動(dòng)物體內(nèi)急性毒性LD50所得結(jié)果進(jìn)行比較，兩者存在著較好的相關(guān)性，其中以原代培養(yǎng)細(xì)胞的相關(guān)性較高；傳代細(xì)胞如PC12、HepG2、B

12、EL-7402等細(xì)胞，培養(yǎng)條件相對(duì)較低，技術(shù)要求不高，也可以在短時(shí)間（24h）內(nèi)評(píng)價(jià)藥物或化合物的急性毒性，與動(dòng)物體內(nèi)LD50數(shù)據(jù)比較也存在著相關(guān)性。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，建立體外細(xì)胞安全性評(píng)價(jià)模型和體系可以預(yù)測(cè)化合物對(duì)人及動(dòng)物的毒性，基本可以部分替代或減少動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，在短時(shí)間內(nèi)對(duì)大規(guī)?；衔?、藥物的急性毒性進(jìn)行評(píng)價(jià)方面具有顯著優(yōu)勢(shì)，具有省時(shí)、省力、節(jié)約經(jīng)費(fèi)、重復(fù)性等優(yōu)點(diǎn)；而選用不同組織來(lái)源的細(xì)胞系代表相應(yīng)靶器官、系統(tǒng)，可以進(jìn)行系統(tǒng)及器官選擇