2023年全國碩士研究生考試考研英語一試題真題(含答案詳解+作文范文)_第1頁
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文檔簡介

1、QT間期延長綜合征(LQTS)是以心電圖QT間期延長為主要特征的一種遺傳性心律失常。其主要原因是心臟的延遲復(fù)極。患者易出現(xiàn)陣發(fā)性的尖端扭轉(zhuǎn)型室性心動過速(TDP)、心室纖顫,甚至導(dǎo)致暈厥和猝死。而且,具有家族性遺傳基因的年輕人常因此而出現(xiàn)心源性休克,其病死率較高。
   目前研究表明,LQTS根據(jù)病因及發(fā)病機制可分為LQT1-12及JLN1-2共14種。LQT4的發(fā)病機制與發(fā)生在染色體4q25-27上的ankyrin-B基因突變

2、導(dǎo)致該基因編碼的ankyrin-B蛋白(ANKB)出現(xiàn)功能異常直接相關(guān)。ANKB是心血管系統(tǒng)中離子通道和轉(zhuǎn)運蛋白信號復(fù)合物的關(guān)鍵部位,結(jié)構(gòu)上可以分為膜結(jié)合結(jié)構(gòu)域、血影結(jié)合結(jié)構(gòu)域、羧基端結(jié)構(gòu)域和“死亡”結(jié)構(gòu)域,而羧基端結(jié)構(gòu)域和“死亡”結(jié)構(gòu)域又合稱為調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域。研究表明,1型Na+-Ca2+交換器(NCX1)、Na+-K+-ATP酶α1/α2(Na+/K+ATPα1/α2)和三磷酸肌醇受體(IP3R)是ANKB的結(jié)合蛋白,ankyrin-B

3、基因突變所致的功能障礙是導(dǎo)致室性心動過速,甚至猝死以及病竇綜合征等一系列復(fù)雜的心電紊亂表型的主要原因。近來,大量的動物模型研究還發(fā)現(xiàn),ANKB在維持正常心功能中發(fā)揮著極其重要的作用。迄今為止,已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的ankyrin-B基因堿基點突變絕大多數(shù)發(fā)生在該基因羧基端結(jié)構(gòu)域和血影蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域,而“死亡”結(jié)構(gòu)域的點突變鮮有報道。本課題前期臨床研究發(fā)現(xiàn)一例LQT4患者,其ankyrin-B基因的點突變位于“死亡”結(jié)構(gòu)域(第40號外顯子)的第460

4、3號堿基突變,即胸腺嘧啶取代了腺嘌呤(T4603A),導(dǎo)致第1535號氨基酸發(fā)生改變,即精氨酸取代了色氨酸(W1535R),作為調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域組成部分的“死亡”結(jié)構(gòu)域點突變導(dǎo)致LQT4的發(fā)生機制尚不清楚。因此,在本研究旨在于探討ankyrin-B基因“死亡”結(jié)構(gòu)域點突變(ANKB-W1535R)導(dǎo)致LQT4的分子生物學(xué)機制。
   本實驗分三部分。第一部分:確定心肌組織腺病毒在體轉(zhuǎn)染方法的有效性。實驗分為陰性對照組(groupⅠ)、

5、心肌多點注射組(groupⅡ)、傳統(tǒng)冠脈灌注組(groupⅢ)和停搏后冠脈灌注組(groupⅣ)。按照上述各方法轉(zhuǎn)染后,觀察各組轉(zhuǎn)染效率的差異,并通過組織學(xué)方法觀察心肌組織形態(tài)改變,Westernblot法檢測各組心外組織(肝、腎、肺)中腺病毒的表達量,以及停搏后冠脈灌注組心肌組織中腺病毒表達量隨時間變化的關(guān)系。
   第二部分:在大體水平探討轉(zhuǎn)染ankyrin-B基因“死亡”結(jié)構(gòu)域點突變(ANKB-W1535R)對大鼠心電及相

6、關(guān)蛋白表達的影響。實驗分為陰性對照組(control)、轉(zhuǎn)染Ad-EGFP組(EGFP組)和轉(zhuǎn)染Ad-EGFP-ANKB-W1535R(ANKB-W1535R組)。運用停搏后冠脈灌注法建立大鼠LQT4模型,觀察ANKB-W1535R對大鼠心電圖的影響;Western blot方法檢測ANKB-W1535R對大鼠心肌組織的ANKB蛋白及其結(jié)合蛋白Na+/K+ATPα1/α2、NCX1和IP3R蛋白表達量的影響。
   第三部分:在

7、細胞水平研究轉(zhuǎn)染ankyrin-B基因“死亡”結(jié)構(gòu)域點突變(ANKB-W1535R)對大鼠心肌細胞Ca2+瞬變及相關(guān)蛋白表達和定位的影響。急性分離大鼠心肌細胞,實驗分為陰性對照組(control)、轉(zhuǎn)染Ad-EGFP組(EGFP組)和轉(zhuǎn)染Ad-EGFP-ANKB W1535R(ANKB-W1535R組),并通過細胞免疫熒光方法觀察ANKB-W1535R對心肌細胞ANKB蛋白及其結(jié)合蛋白Na+/K+ATPα1/α2、NCX1和IP3R蛋白

8、表達量及定位的影響。
   結(jié)果
   第一部分:確定心肌組織腺病毒在體轉(zhuǎn)染方法的有效性
   (一)各組大鼠心肌組織EGFP熒光強度及轉(zhuǎn)染效率的比較
   熒光顯微鏡下陰性對照組心肌組織可見微弱的自發(fā)熒光。轉(zhuǎn)染各組4日后大鼠心肌組織均有明顯的綠色熒光,其中心肌多點注射組熒光分布不均,傳統(tǒng)冠脈灌注組僅有點片狀熒光,停搏后冠脈灌注組熒光均勻分布。傳統(tǒng)冠脈灌注組轉(zhuǎn)染效率最低(5.29±4.9%),分別與心肌多

9、點注射組(61.9±9.7%)和停搏后冠脈灌注組(52.9±7.4%)相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01),而心肌多點注射組與停搏后冠脈灌注組的轉(zhuǎn)染效率相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。
   (二)各組EGFP在左心室表達量的比較
   采用Western Blot分析各組EGFP在左心室的表達量,心肌多點注射組及停搏后冠脈灌注組的EGFP表達量顯著強于傳統(tǒng)冠脈灌注組(P<0.01),而心肌多點注射組及停搏后冠脈灌

10、注組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。
   (三)各組大鼠心臟及心外組織(腎臟、肝臟、肝臟)中EGFP表達量的比較
   采用Western Blot分析各組EGFP在大鼠腎臟、肺臟、心臟及肝臟的表達量,心肌多點注射組和停搏后冠脈灌注組心臟的EGFP表達量顯著高于腎、肺和肝的EGFP表達量(P<0.01);而傳統(tǒng)冠脈灌注組的肝臟的EGFP表達量則顯著高于心、腎和肺的EGFP表達量(P<0.05),但心臟的EGFP表達量

11、與腎和肺的EGFP表達量差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。
   (四)停搏后冠脈灌注組各不同時間點EGFP表達量的比較
   停搏后冠脈灌注組的EGFP表達量隨時間的延長而明顯減弱。與陰性對照組相比,轉(zhuǎn)染后4d組EGFP表達量顯著增高(2.484±0.315,P<0.01);與轉(zhuǎn)染4d組相比,轉(zhuǎn)染7 d(0.234±0.040)、10 d(0.132±0.038)及14d組(0.045±0.008) EGFP表達量明顯

12、降低,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01);而與陰性對照組相比,轉(zhuǎn)染后10、14d的EGFP表達量差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。
   (五)不同轉(zhuǎn)染方法對大鼠心肌組織形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響比較
   陰性對照組心肌細胞形態(tài)良好,結(jié)構(gòu)完整,橫紋清晰;心肌多點注射組心肌組織呈現(xiàn)大量炎性細胞浸潤,且有部分心肌壞死;傳統(tǒng)冠脈灌注組及停搏后冠脈灌注組心肌細胞形態(tài)良好,心肌組織結(jié)構(gòu)完整,無炎性細胞浸潤。
   第二部分:在大體

13、水平探討ANKB-W1535R對大鼠心電及相關(guān)蛋白表達量的影響
   (一)轉(zhuǎn)染ANKB-W1535R對大鼠心電圖的影響
   1、轉(zhuǎn)染ANKB-W1535R對大鼠心電圖形態(tài)的影響
   轉(zhuǎn)染4d后,各組大鼠檢測心電圖,心電圖形態(tài)均無顯著變化。ANKB-W1535R組的1只大鼠在運動后心電圖出現(xiàn)了偶發(fā)的心臟逸搏。腹腔注射腎上腺素模擬大鼠應(yīng)激后,三組大鼠均無死亡。EGFP組在運動后心率加快,心電圖形態(tài)無改變,而AN

14、KB-W1535R組中3只大鼠在運動后心率加快(占42.9%),4只心率變異性高(占57.1%)。運動加應(yīng)激后ANKB-W1535R組4只大鼠在應(yīng)激5-15min后均出現(xiàn)了多形性室性心動過速,而陰性對照組及EGFP組大鼠在運動加應(yīng)激后只出現(xiàn)心率增快,未出現(xiàn)心電圖形態(tài)的變化。
   轉(zhuǎn)染ANKB-W1535R對大鼠心電圖QT間期(QTc)的影響:不同處理組之間心電圖QTc差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=7.769,P=0.004)。ANKB

15、-W1535R組QTc最高(206.99±32.70) ms。采用LSD兩兩比較可見,ANKB-W1535R組與陰性對照組(155.17±13.96)和EGFP組(168.83±21.91)相比,QTc差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P值分別為0.002,0.014);而陰性對照組與EGFP組相比,QTc差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.353)。
   轉(zhuǎn)染ANKB-W1535R對大鼠心電圖PR、QRS間期及P波的影響:不同處理組之間PR、QRS間

16、期及P波差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(F值分別為0.674,2.031,0.257;P值分別為0.524,0.164,0.777)。
   2、轉(zhuǎn)染ANKB-W1535R對大鼠心率的影響
   運動加應(yīng)激后,不同處理組之間心率差異無統(tǒng)計學(xué)意義(F=0.619,P=0.551)。ANKB-W1535R組大鼠在應(yīng)激后25 min內(nèi)心率顯示高度的變異性,心率最高時達586 BPM,最低時只有248.62 BPM。陰性對照組和EGFP組大

17、鼠心率隨時間的變化不大,陰性對照組心率在394 BPM至430 BPM之間變化,EGFP組心率在381 BPM至478 BPM之間變化。
   綜上所述,轉(zhuǎn)染ANKB-W1535R可以導(dǎo)致大鼠QTc延長、偶發(fā)心臟逸搏,應(yīng)激后心率變異性增高、出現(xiàn)多形性室性心動過速,而這些均符合人類LQT4的心電圖特點,因此,我們判斷轉(zhuǎn)染ANKB-W1535R建立LQT4模型成功。
   (二)Western blot測定ANKB、Na+/

18、K+ATPα1/α2、NCX1和IP3R蛋白表達水平
   1、轉(zhuǎn)染ANKB-W1535R對大鼠心肌組織ANKB表達量的影響:不同處理組之間ANKB表達量差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=6.382,P=0.033)。ANKB-W1535R組大鼠的ANKB蛋白表達水平最低(0.489±0.091),分別與陰性對照組(0.793±0.139)及EGFP組(0.764±0.110)相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P值分別為0.018、0.026);陰性對

19、照組與EGFP組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.766)。因此,轉(zhuǎn)染ANKB-W1535R能導(dǎo)致ANKB表達量減少。
   2、轉(zhuǎn)染ANKB-W1535R對大鼠心肌組織Na+/K+ATPaseα1表達量的影響:不同處理組之間Na+/K+ATPaseα1表達量差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=13.875,P=0.006)。ANKB-W1535R組大鼠的Na+/K+ATPaseα1蛋白表達水平最低(0.620±0.119),分別與陰性對照組(1

20、.291±0.193)及EGFP組(1.031±0.151)相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P值分別為0.002、0.019);陰性對照組與EGFP組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.090)。因此,轉(zhuǎn)染ANKB-W1535R能導(dǎo)致Na+/K+ATPα1表達量減少。
   3、轉(zhuǎn)染ANKB-W1535R對大鼠心肌組織Na+/K+ATPaseα2表達量的影響:不同處理組之間Na+/K+ATPaseα2表達量差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=5.665,P=

21、0.042)。ANKB-W1535R組大鼠的Na+/K+ATPaseα2蛋白表達水平最低(0.101±0.021),分別與陰性對照組(0.196±0.040)及EGFP組(0.201±0.055)相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P值分別為0.030、0.024);陰性對照組與EGFP組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.883)。因此,轉(zhuǎn)染ANKB-W1535R能導(dǎo)致Na+/K+ATPα2表達量減少。
   4、ANKB-W1535R對大鼠心肌

22、組織NCX1表達量的影響:不同處理組之間NCX1表達量差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=7.033,P=0.027)。ANKB-W1535R組大鼠的NCX1蛋白表達水平最低(0.370±0.151),分別與陰性對照組(0.741±0.141)及EGFP組(0.694±0.098)相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P值分別為0.014、0.024);陰性對照組與EGFP組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.682)。因此,轉(zhuǎn)染ANKB-W1535R能導(dǎo)致NCX1表達量

23、減少。
   5、轉(zhuǎn)染ANKB-W1535R對大鼠心肌組織IP3R表達量的影響:不同處理組之間IP3R表達量差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=6.511,P=0.031)。ANKB-W1535R組大鼠的IP3R蛋白表達水平最低(0.530±0.125),分別與陰性對照組(1.037±0.188)及EGFP組(0.960±0.228)相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P值分別為0.015、0.030);陰性對照組與EGFP組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.

24、629)。因此,轉(zhuǎn)染ANKB-W1535R能導(dǎo)致IP3R表達量減少。
   第三部分:在細胞水平探討轉(zhuǎn)染ANKB-W1535R對大鼠心肌細胞Ca2+瞬變及相關(guān)蛋白表達和定位的影響
   (一)心肌細胞重組腺病毒載體的轉(zhuǎn)染效率
   急性分離的心肌細胞成活率可達80%以上。在心肌細胞用重組腺病毒載體轉(zhuǎn)染48 h后,細胞存活率達70%以上,轉(zhuǎn)染效率約為100%。
   (二)心肌細胞ANKB、Na+/K+AT

25、Pα1/α2、NCX1及IP3R的免疫熒光染色
   1、ANKB免疫熒光染色結(jié)果:陰性對照組和EGFP組心肌細胞的ANKB沿細胞橫管(T管)區(qū)域呈條形分布,熒光清晰明亮。而ANKB-W1535R組ANKB分布紊亂,熒光強度最弱(29.441±4.474),分別與陰性對照組(52.425±7.619)及EGFP組(48.762±6.573)相比有顯著差異(P值分別為0.004、0.010);陰性對照組與EGFP組相比差異無統(tǒng)計學(xué)

26、意義(P=0.507)。
   2、Na+/K+ATPα1免疫熒光染色結(jié)果:陰性對照組和EGFP組心肌細胞的Na+/K+ATPα1在細胞膜及橫管(T管)區(qū)域均有染色,熒光清晰明亮。而ANKB-W1535R組Na+/K+ATPα1分布紊亂,熒光強度最弱(16.110±3.640),分別與陰性對照組(42.083±11.637)及EGFP組(44.363±7.345)相比有顯著差異(P值分別為0.008、0.006);陰性對照組與E

27、GFP組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.746)。
   3、Na+/K+ATPα2免疫熒光染色結(jié)果:陰性對照組和EGFP組心肌細胞的Na+/K+ATPα2沿細胞橫管(T管)區(qū)域呈條形分布,熒光清晰明亮。而ANKB-W1535R組Na+/K+ATPα2分布紊亂,熒光強度最弱(23.191±2.997),分別與陰性對照組(42.029±7.672)及EGFP組(45.202±8.269)相比有顯著差異(P值分別為0.007、0.01

28、4);陰性對照組與EGFP組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.585)。
   4、NCX1免疫熒光染色結(jié)果:陰性對照組和EGFP組心肌細胞的NCX1沿細胞橫管(T管)區(qū)域呈條形分布,熒光清晰明亮。而ANKB-W1535R組NCX1分布紊亂,熒光強度最弱(10.219±3.330),分別與陰性對照組(42.582±7.197)及EGFP組(39.483±5.372)相比有顯著差異(P值分別為0.000、0.001);陰性對照組與EG

29、FP組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.518)。
   5、IP3R免疫熒光染色結(jié)果:陰性對照組和EGFP組心肌細胞的IP3R沿細胞橫管(T管)區(qū)域呈條形分布,熒光清晰明亮。而ANKB-W1535R組IP3R分布紊亂,熒光強度最弱(12.386±3.862),分別與陰性對照組(40.514±5.659)及EGFP組(40.509±9.610)相比有顯著差異(P值均為0.002);陰性對照組與EGFP組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.

30、999)。
   綜上所述,轉(zhuǎn)染ANKB-W1535R能導(dǎo)致ANKB及其結(jié)合蛋白Na+/K+ATPα1/α2、NCX1及IP3R表達量減少,并減弱這些蛋白在橫管靶向定位功能。
   (三)心肌細胞Ca2+瞬變
   不同處理組心肌細胞的收縮性(場刺激引起細胞長度縮短的最大值與收縮前長度的比值):陰性對照組為(9.21±1.23)%,EGFP組為(9.20±1.50)%,ANKB-W1535R組為(8.97±0.9

31、9)%,各組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(F=1.348,P=0.261),說明心肌細胞的收縮性并未受影響;ANKB-W1535R組Ca2+瞬變峰值(△F/F0)最高(1.43±0.14),與陰性對照組(1.03±0.19)和EGFP組(0.98±0.21)相比,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P值分別為0.036,0.023);不同處理組的Ca2+瞬變上升時間(rise time)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(F=1.384,P=0.252);不同處理組的Ca2+瞬變

32、半數(shù)衰減時間(FDHM)差異顯著(F=79.19,P=0.000),與陰性對照組(129.87±11.91 ms)及EGFP組為(126.59±13.77ms)相比,ANKB-W1535R組(153.64±23.40ms)的FDHM最高(P值均為0.000),說明Ca2+回收機制受損。
   結(jié)論
   1、改良過的停搏后冠脈灌注法應(yīng)用于轉(zhuǎn)染大鼠心肌細胞,具備較高轉(zhuǎn)染效率、轉(zhuǎn)染分布均勻、心外組織轉(zhuǎn)染量少、存活率較高及對心

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