KCNJ5基因Gly387Arg突變導致家族性長QT綜合征.pdf

1、背景：心源性猝死嚴重危害人類健康，發(fā)病率高達0.1％-0.2％，僅在美國每年就可導致大約30萬-40萬人死亡。90％猝死的患者可以找到心臟病因，由于猝死后存活的患者有限，因此至少5％患者沒有潛在的心臟病原因，這些患者大多數年齡小于40歲，其中長QT綜合征是引起這部分病人猝死的主要原因之一。長QT綜合征又稱心室復極延長綜合征，其特征性表現是心電圖上QT間期延長，T波異常，易產生尖端扭轉型室速和室顫。長QT綜合征按病因通常可分為獲得性和遺傳

2、性兩種類型。獲得性長QT綜合征雖也具有遺傳易感性，但主要與心肌局部缺血、電解質紊亂和應用某些藥物等因素有關，臨床上祛除這些誘發(fā)因素?？捎行е委?。而遺傳性長QT綜合征的發(fā)生機制要復雜得多，又無有效的治療措施，因此長期以來一直是心律失常領域的研究焦點。從Jervell和Lange-Nielsen于1957年在世界上報道了第一個呈常染色體隱性遺傳的長QT綜合征家系，至今已經已經發(fā)現了10個基因的數百個突變可導致10種不同類型的長QT綜合征，初

3、步揭示了部分長QT綜合征的分子缺陷及其作用機制。然而，已經識別出的10個長QT綜合征致病基因只可以解釋大約80％的長QT綜合征患者的病因和發(fā)病機制，仍有20％左右的長QT綜合征患者的致病基因有待識別。不僅如此，由于長QT綜合征既具有顯著地遺傳異質性，不同患者的致病基因不一定相同，即使基因相同，致病突變也多不同：同時存在巨大的表型差異，同樣是長QT綜合征患者，有的毫無癥狀，有的則出現暈厥和猝死等表現，因而有必要對所有無血緣關系的長QT綜合

4、征尤其是家族性長QT綜合征患者進行分子學遺傳研究。 目的：定位新的家族性長QT綜合征的致病基因座，識別新的家族性長QT綜合征的致病基因，并在細胞水平研究其作用機制，為長OT綜合征的早期診斷、預后評估、預防咨詢以及基因治療奠定基礎。 方法：收集長QT綜合征家系和無血緣關系的健康對照者。采集外周靜脈血，常規(guī)抽提基因組DNA。在前期已經排除了所報道的10個長QT綜合征相關基因KCNQ1、KCNH2、SCN5A、Ankyrin

5、B、KCNE1、KCNE2、KCNJ2、CACNA1C、CAV3和SCN4B的基礎上，進行微衛(wèi)星全基因組掃描、基因分型、單倍型和連鎖分析，確定候選基因在染色體上的座位。運用生物信息學知識確定所定位區(qū)域的首選候選基因，通過PCR-測序和序列比對分析以期發(fā)現家族性長QT綜合征先證者的基因突變。然后，分別在發(fā)生基因突變的家系和健康對照者中篩查所發(fā)現的突變基因，以評估該基因突變在不同人群中的流行率，并對比分析突變區(qū)域氨基酸在各物種間的保守性，初

6、步確定所發(fā)現的突變是致病突變而不是罕見的分子多態(tài)。運用分子克隆技術克隆所發(fā)現的潛在致病基因的野生型，插入到克隆載體pGEM-T，針對所發(fā)現的突變通過定位誘變獲得該基因的突變體，再通過酶切反應及測序證實后轉化感受態(tài)細胞，中量制備所識別出的長QT綜合征基因的重組質粒，在體外逆轉錄制備適量的野生型和突變型長QT綜合征基因的cRNA，通過顯微注射裝置注入爪蟾卵母細胞，運用雙電極電壓鉗在細胞水平研究突變基因產物所發(fā)生的電生理改變。 結果：

7、獲得了一個長QT綜合征大家系和500例無血緣關系的健康對照者的臨床資料和血標本，繪制了該家系的系譜圖，抽提了基因組DNA。通過微衛(wèi)星全基因組掃描獲得了家系成員的基因型，構建了單倍型圖。通過連鎖分析，確定該家系長QT綜合征的候選基因在染色體上的座位是11q23-24(在11號染色體上，兩標記位點D11S990和D11S4123之間的5.34cM的間隔區(qū)域，其中在位點D11S4123在θ=0.00時得到最大的LOD值5.4183)。運用生物

8、信息學知識確定所定位區(qū)域的首選候選基因為KCNJ1和KCNJ5，通過PCR-測序和序列比對分析發(fā)現家族性長QT綜合征先證者的KCNJ5基因發(fā)生了一個改變氨基酸的雜和錯義突變，即KCNJ5基因(基因登錄號NM_000890)第1473位的鳥嘌呤(即第387位密碼子的第一個核甘酸)變成了胞嘧碇(1473 G→C)，相應地其所編碼的離子通道蛋白的第387位的甘氨酸變成了精氨酸(Gly387→Arg)。相同的突變存在于家系中所有的患者，但500

9、例無血緣關系的健康對照者均無此突變，也沒有在該家族性長QT綜合征先證者中發(fā)現KCNJ1基因存在突變。多物種序列比對顯示KCNJ5基因Gly3 87→Arg突變具有高度保守性，初步確定所發(fā)現的突變是致病突變而不是罕見的分子多態(tài)。運用分子克隆技術成功克隆了所發(fā)現的潛在致病基因KCNJ5的野生型，插入到克隆載體pGEM-T，針對所發(fā)現的突變通過定位誘變獲得該基因的突變體，再通過酶切反應及測序證實后中量制備了該基因的重組質粒，在體外逆轉錄制備了

10、適量的野生型和突變型KCNJ5的cRNA，通過顯微注射裝置注入爪蟾卵母細胞，全細胞雙電極電壓鉗研究發(fā)現KCNJ5的Gly387→Arg突變?yōu)楣δ塬@得性，使KCNJ5基因所編碼的鉀離子通道在所有電壓水平的電流密度均大幅度升高，在-50mV，突變型KCNJ5和野生型KCNJ5的電流密度分別為-23.2±1.2pA/pF(n=11)和-8.5±0.8pA/PF(n=8)(p<0.05)；電壓為-20mV時，兩者的電流密度分別為15.2±1.1