ZP3基因突變引起空卵泡綜合征導(dǎo)致女性不孕.pdf

1、本文主要從以下幾方面進行論述：
　　第一章 空卵泡綜合征致病突變的定位研究
　　目的:空卵泡綜合征(EFS)是指在促排卵周期或自然周期中，超聲監(jiān)測下卵泡大小、數(shù)目及血清雌激素水平均在正常范圍，但經(jīng)反復(fù)抽吸、沖洗均無法獲得卵母細(xì)胞。目前臨床上對于反復(fù)發(fā)生EFS的患者尚無有效助孕方法，為獲得妊娠，這部分不孕女性只能借助于供卵。關(guān)于EFS的發(fā)病機制至今尚未明確，有研究者認(rèn)為與卵泡提早閉鎖、卵巢老化等因素有關(guān)。對于EFS的遺傳學(xué)發(fā)病

2、機制，既往研究包括LHCGR基因突變和2號染色體倒位，但均為單個病人或單個小家系的研究，缺少令人信服的大家系研究。筆者前期收集了一個有六個不孕癥患者的大家系（家系Ⅰ），先證者及其姐姐的各三個體外助孕周期獲得的卵冠丘復(fù)合物幾乎全部為空黏液團，僅極少數(shù)存在退變的卵母細(xì)胞，表現(xiàn)為EFS;先證者的兩個姑姑與兩個堂姐妹也同樣為不明原因不孕癥患者。本章研究擬通過此大家系，定位EFS的致病突變。
　　方法:為明確EFS的致病基因，首先對家系Ⅰ進

3、行全基因組連鎖分析，找到連鎖不平衡區(qū)域。該家系為常染色體顯性遺傳，致病突變由父親傳遞。為進一步明確致病突變，選擇家系Ⅰ中的三個患者、兩個突變攜帶者和兩個正常女性對照進行全外顯子組測序。對全外顯子組測序數(shù)據(jù)進行生物信息分析并對候選位點進行驗證、常用數(shù)據(jù)庫過濾和正常生育女性對照過濾。將最終篩選出的位點在另一個EFS大家系（家系Ⅱ）和EFS散發(fā)病人中驗證，并追溯攜帶此突變的散發(fā)病人的家族史，明確變異的來源。最后綜合上述結(jié)果，得到導(dǎo)致EFS的致

4、病突變位點。
　　結(jié)果:經(jīng)全基因組連鎖分析發(fā)現(xiàn)該家系的連鎖不平衡區(qū)域位于7p12.3-q21.13。全外顯子組測序結(jié)果經(jīng)過生物信息分析及驗證、常用數(shù)據(jù)庫和正常生育女性對照中過濾后，得到候選位點:ZP3 c.400 G＞A(p.Ala134Thr)雜合錯義突變。該突變位于家系Ⅰ的連鎖不平衡區(qū)域中，與疾病狀態(tài)共分離。在家系Ⅱ中，該突變亦與疾病狀態(tài)共分離。經(jīng)連鎖分析證實，在這兩個大家系中，此突變?yōu)楠毩l(fā)生，不存在同源性。在21例EFS散

5、發(fā)病例中，有2例攜帶同一位點相同的突變，追溯家族史發(fā)現(xiàn)其中一位患者的突變?yōu)樾掳l(fā)突變(de novo)。
　　結(jié)論:本研究是EFS的首個大家系研究，通過兩個EFS大家系和EFS散發(fā)病例研究發(fā)現(xiàn)ZP3 c.400 G＞A(p.Ala134Thr)雜合錯義突變可能為EFS的致病突變。本研究也為EFS提供了潛在的診斷靶點:對于取卵呈現(xiàn)空黏液團無法獲卵的不孕癥患者可早期進行ZP3 c.400 G＞A的突變篩查，若患者攜帶此突變，則應(yīng)避免反復(fù)

6、促排卵嘗試，盡早轉(zhuǎn)換助孕策略，從而減輕患者的經(jīng)濟負(fù)擔(dān)和精神壓力，獲得更好的助孕結(jié)局。
　　第二章 致病突變的體外功能研究
　　目的:ZP3基因編碼的ZP3糖蛋白是卵母細(xì)胞透明帶的重要組分。透明帶是包繞卵母細(xì)胞的結(jié)構(gòu)，是卵母細(xì)胞的“外衣”，在卵母細(xì)胞發(fā)育、受精及早期胚胎發(fā)育過程中起到重要的作用。p.Ala134Thr突變位于ZP3的ZP功能域，ZP功能域在透明帶組裝過程中發(fā)揮重要的作用。本章將通過體外實驗對p.Ala134Th

7、r進行功能研究。
　　方法:首先通過卵母細(xì)胞免疫熒光染色和卵巢活檢組織石蠟切片染色等方法，對空卯泡綜合征患者卵母細(xì)胞的具體異常進行表征。用PyMol軟件預(yù)測突變對ZP3糖蛋白分子三維結(jié)構(gòu)的影響。隨后通過構(gòu)建野生型、突變型表達載體，并轉(zhuǎn)染至中國倉鼠卵巢細(xì)胞(CHO-K1)中，裂解細(xì)胞獲得總蛋白，利用免疫共沉淀技術(shù)探究突變型蛋白對蛋白互作的影響。
　　結(jié)果:家系Ⅰ先證者穿刺取卵獲得的絕大多數(shù)為空黏液團，極少數(shù)包含無透明帶的退變卵

8、母細(xì)胞。免疫熒光顯示卵母細(xì)胞核物質(zhì)完全崩解，且卵外周無ZP3信號聚集。卵巢活檢石蠟切片示卵泡中的卵母細(xì)胞無透明帶結(jié)構(gòu)且呈退變狀態(tài)。免疫共沉淀實驗證實野生型ZP3可與ZP2結(jié)合，突變型ZP3不與ZP2結(jié)合，但野生型、突變型ZP3同時存在時，突變型ZP3通過與野生型ZP3結(jié)合以阻止野生型ZP3與ZP2的結(jié)合，發(fā)揮顯性負(fù)效應(yīng)的作用，妨礙透明帶的形成。
　　結(jié)論:p.Ala134Thr突變發(fā)揮顯性負(fù)效應(yīng)的作用，抑制ZP3與ZP2的結(jié)合，妨

9、礙透明帶的形成，引起卵母細(xì)胞退變，表現(xiàn)為空卵泡綜合征。
　　第三章 致病突變的小鼠模型研究
　　目的:透明帶的結(jié)構(gòu)在哺乳動物中具有很高的保守性。小鼠透明帶由Zp1、Zp2、Zp3基因編碼的糖蛋白構(gòu)成，由Zp2和Zp3相互連接成纖維狀結(jié)構(gòu)，Zp1連接這些纖維構(gòu)成三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。在既往的報道中，Zp3基因敲除小鼠完全不孕，超數(shù)排卵實驗獲得的卵冠丘復(fù)合物大多為空黏液團，少數(shù)取到的卵母細(xì)胞無透明帶，這與本研究中空卵泡綜合征患者的表型極

10、為相似。人和小鼠的ZP3均包含424個氨基酸，氨基酸序列同源性達67％。除外小鼠、大鼠等嚙齒類動物，ZP3糖蛋白的第134位氨基酸位點在各物種中均為丙氨酸(Ala)。小鼠Zp3糖蛋白在此位點為性質(zhì)與丙氨酸類似的纈氨酸(Val)。因此，在構(gòu)建點突變小鼠模型時，我們將小鼠Zp3基因一條鏈突變?yōu)樘K氨酸(Thr)，另一條鏈保持不變，仍為纈氨酸，即獲得p.Val134Thr小鼠。本章將對p.Val134Thr點突變小鼠進行研究，進一步驗證該突變的

11、功能。
　　方法:利用CRISPR-Cas9編輯的“類精子細(xì)胞”單倍體細(xì)胞系制備p.Val134Thr點突變小鼠，與性成熟的野生型雄鼠合籠觀察生育力;對21天的小鼠行超數(shù)排卯，統(tǒng)計獲卯?dāng)?shù);分別取21天和6周齡小鼠卵巢組織脫水、石蠟包埋，對組織切片行HE染色、ZP3免疫組織化學(xué)(IHC)和過碘酸-雪夫染色(PAS)，觀察組織切片中各級卵泡中卯母細(xì)胞的形態(tài)。
　　結(jié)果:p.Val134Thr點突變純合小鼠完全不孕，雜合子小鼠生育

12、力與野生型相比雖略有降低，但無統(tǒng)計學(xué)差異。超數(shù)排卵實驗中，雜合子、純合子小鼠獲卵數(shù)與野生型小鼠相比均存在顯著差異。雜合子小鼠獲卵數(shù)約為野生型小鼠的1/2-2/3，卵母細(xì)胞透明帶比野生型小鼠薄;純合子小鼠絕大部分的卵冠丘復(fù)合物為空黏液團，少數(shù)獲得的卵母細(xì)胞無透明帶且大小不一，為退變裂解卵。卵巢切片HE、IHC、PAS染色示雜合子小鼠卵母細(xì)胞形態(tài)大致正常，但透明帶相比于野生型小鼠略薄;純合小鼠卵母細(xì)胞缺乏透明帶。
　　結(jié)論:p.Val