BPES綜合征伴不孕癥家系FOXL2基因突變檢測及功能研究.pdf

1、研究背景:
　　瞼裂狹小、倒轉(zhuǎn)型內(nèi)眥贅皮和上瞼下垂綜合征(blepharophimosis-ptosis-epicanthus inversus syndrome，BPES)的發(fā)病率為1/5，000，作為一種罕見的常染色體顯性遺傳病，它的主要臨床表現(xiàn)是雙側(cè)上瞼下垂、瞼裂狹小、逆向內(nèi)眥贅皮、內(nèi)眥間距過寬等，次要表現(xiàn)是鼻梁扁平、低位耳等。BPES共分為兩型:Ⅰ型和Ⅱ型。Ⅰ型表現(xiàn)為眼瞼發(fā)育異常并且受累女性伴有不孕，Ⅱ型僅僅表現(xiàn)為眼瞼發(fā)育

2、的異常，男女患者生育功能未受影響。兩型的主要區(qū)別主要是Ⅰ型受累女性同時伴有不孕癥，然而由于BPESⅠ型女性的基因型與表型并不完全一致，其所引起的女性不孕的發(fā)病機制尚不明確。迄今為止，臨床上尚未找到可靠有效的方法來治療BPESⅠ型患者的不孕癥。雖然可以通過重建手術(shù)來矯正BPES患者的上瞼下垂，以改善其面貌，但BPESⅠ型所伴發(fā)的不孕癥給女性患者造成身心上的巨大痛苦。此外，由于BPES患者尤其是Ⅰ型女性患者的臨床表型變異程度較大，使得臨床醫(yī)

3、生較難對該病進行準確的診斷，從而使該類患者無法得到及時有效的治療。更重要的是，該病具有較高的家族遺傳性，根據(jù)孟德爾遺傳定律計算，BPES患者子代的再發(fā)病風險約為50％，因此對BPES患者進行常規(guī)的產(chǎn)前遺傳咨詢，通過產(chǎn)前篩查、診斷等必要措施避免患病兒的出生就顯得尤為重要。Forkhead box L2（OXL2）基因是定位于染色體3q23(3號染色體2區(qū)3帶)的單一外顯子基因。OXL2基因是一個在維持卵泡發(fā)育、卵巢正常功能中發(fā)揮重要作用的

4、常染色體基因，主要在中小卵泡期的顆粒細胞中表達，通過抑制下游靶基因CYP11A1、CYP19A1、CCND2等啟動子的轉(zhuǎn)錄活性，從而在卵泡顆粒細胞的增殖、分化、卵巢類固醇激素的生成過程中發(fā)揮重要作用。OXL2基因突變會導(dǎo)致卵巢早衰的發(fā)生。研究表明FOXL2基因是BPES最常見的、首位致病候選基因，在BPESⅠ型和Ⅱ型患者中均發(fā)現(xiàn)有FOXL2基因突變的存在。但OXL2基因突變?nèi)绾螌ο掠位騿幼拥霓D(zhuǎn)錄功能產(chǎn)生影響、引起POF并導(dǎo)致BPES

5、不孕癥發(fā)生的具體分子機制尚未完全明確。
　　研究目的:
　　本研究中，我們主要關(guān)注FOXL2基因突變在BPESⅠ型患者不孕癥發(fā)生發(fā)展中的作用機制。我們對一個BPES不孕癥家系進行家系遺傳學分析、對FOXL2基因突變進行篩查并對新發(fā)突變進行功能預(yù)測和體外實驗功能驗證，從而探討OXL2基因突變與該家系患者不孕癥發(fā)病的相關(guān)性，以期給相關(guān)不孕癥病人的臨床診療及遺傳咨詢等提供更多的依據(jù)和幫助。
　　研究方法:
　　1.以2

6、015年就診于山東大學附屬生殖醫(yī)院的伴有BPES表現(xiàn)的不孕癥患者的家系為研究對象，對家系成員進行臨床表型及遺傳規(guī)律分析。
　　2.抽取家系成員的外周血，以在本院招募的223例卵巢功能正常且不伴有BPES的育齡期健康婦女外周血為正常對照，采用直接測序法對FOXL2基因的外顯子區(qū)進行突變位點篩查檢測。
　　3.應(yīng)用生物信息學軟件Polyphen-2、PROVEN和SIFT等對FOXL2基因突變對蛋白質(zhì)的影響進行功能預(yù)測。

7、　　4.構(gòu)建野生型和突變型OXL2基因質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染至HEK293細胞后，采用雙熒光素酶報告系統(tǒng)檢測基因轉(zhuǎn)錄活性、細胞免疫熒光技術(shù)檢測蛋白表達及細胞定位。
　　研究結(jié)果:
　　1.家系中的兩例患者均符合BPES的臨床診斷，且受累的女性均患有不孕癥，符合BPES分型中的Ⅰ型，遺傳方式符合單基因常染色體顯性遺傳方式。
　　2.在該BPES不孕癥家系中發(fā)現(xiàn)了FOXL2基因編碼區(qū)第188位的胸腺嘧啶突變?yōu)橄汆堰?，為新發(fā)突變c.18

8、8T＞A，第63位氨基酸由Ile變?yōu)锳sn(p.I63N)，突變位點位于FKH結(jié)構(gòu)域，該突變位點(p.I63N)及其上下游序列在物種間高度保守。
　　3.功能預(yù)測提示p.I63N突變對FOXL2蛋白功能有損害。這個新發(fā)突變位點為我們首次發(fā)現(xiàn)。
　　4.體外轉(zhuǎn)染HEK293細胞的功能實驗證實，該錯義突變p.I63N減弱了FOXL2對下游基因CYP19A1和CCND2啟動子的轉(zhuǎn)錄抑制作用(P＜0.05)，但對CYP11A1啟動子

9、的轉(zhuǎn)錄抑制無明顯影響（P＞0.05），而且對CYP11A1、CYP19A1和CCⅣD2三個下游靶基因的啟動子都沒有顯性負效應(yīng);亞細胞定位及蛋白表達定位同野生型相比未見明顯改變。
　　研究結(jié)論:
　　1.對一個不孕癥家系進行家系分析，符合BPES的臨床診斷，患者有典型的眼瞼異常并伴有不孕癥屬于Ⅰ型BPES患者。
　　2.在患者OXL2基因中檢測到了一個新發(fā)突變，位于第188位堿基的胸腺嘧啶突變?yōu)橄汆堰?c.188T＞A)

10、，導(dǎo)致第63位氨基酸的異亮氨酸變?yōu)樘於０?p.Ile63Asn，p.I63N)，該突變位于FKH結(jié)構(gòu)域，拓展了BPES基因錯義突變譜。
　　3.蛋白功能預(yù)測軟件顯示，p.I63N突變對FOXL2蛋白功能的影響較大。
　　4.突變p.I63N有可能通過單倍劑量不足的機制，影響FOXL2對下游調(diào)控基因CYP19A1和CCND2啟動子的轉(zhuǎn)錄抑制，進而導(dǎo)致顆粒細胞功能及類固醇激素生成的異常，最終導(dǎo)致不孕癥的發(fā)生。該研究揭示了該BP