中國(guó)顱骨鎖骨發(fā)育不良綜合征患者的基因突變及相關(guān)功能研究.pdf

1、顱骨鎖骨發(fā)育不良(cleidocranialdysplasia，CCD)是一種少見的遺傳性疾病，多為常染色體顯性遺傳，其致病基因定位于染色體6p21，并表明成骨細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子(RUNX2／CBFA1／PEBP2)的雜合突變、基因插入、缺失等是造成CCD的重要原因。國(guó)內(nèi)有關(guān)CCD患者的致病基因突變報(bào)道較少，尚未涉及到基因突變對(duì)蛋白功能的影響以及相關(guān)的細(xì)胞學(xué)研究。本研究收集5個(gè)中國(guó)CCD家系，進(jìn)行基因突變檢測(cè)及相關(guān)功能研究，填補(bǔ)國(guó)內(nèi)有關(guān)

2、研究的空白；并利用收集到的標(biāo)本進(jìn)行牙齒組織學(xué)結(jié)構(gòu)分析以及牙髓細(xì)胞培養(yǎng)，探究CCD牙髓細(xì)胞的生物學(xué)特性及基因表達(dá)差異，從一個(gè)全新的角度對(duì)CCD患者的發(fā)病機(jī)理進(jìn)行探討。 本文內(nèi)容共分為三部分，小結(jié)如下： 一、顱骨鎖骨發(fā)育不良綜合征患者的臨床檢查與分析 本部分主要是CCD相關(guān)病例的篩選、診斷，首先是對(duì)具有相關(guān)臨床癥狀的先證者詳細(xì)采集病史，明確單發(fā)或家族聚集傾向；利用X線檢查全面了解患者及其父母的全身骨骼發(fā)育情況；詳細(xì)進(jìn)

3、行口腔檢查，記錄恒牙萌出及乳牙遲萌以及埋藏牙、多生牙等典型臨床癥狀；綜合上述臨床資料，明確診斷。本研究中，五病例均具有明顯的臨床特征，比較典型的CCD特殊面容，口腔內(nèi)表現(xiàn)為乳牙滯留，多數(shù)恒牙及多生牙埋伏于頜骨中不能萌出(除第4例沒(méi)有明顯多生牙外)；均伴有鎖骨發(fā)育不全，囟門閉合遲緩，身材矮小等癥狀。并發(fā)現(xiàn)一些新的臨床畸形表現(xiàn)，如家系3先證者的尺、橈骨向橈側(cè)偏斜致肱尺關(guān)節(jié)、肱橈關(guān)節(jié)畸形，肘外側(cè)呈三角變形；家系2先證者的多生牙發(fā)生在磨牙區(qū)。

4、 利用收集的家系5先證者姐姐(CCD患者)的牙齒標(biāo)本進(jìn)行組織學(xué)分析，光鏡及掃描電鏡下觀察牙齒磨片，發(fā)現(xiàn)恒牙牙冠釉質(zhì)結(jié)構(gòu)不清晰以及牙本質(zhì)小管部分閉塞、管周牙本質(zhì)礦化低，釉牙本質(zhì)界缺乏典型的連續(xù)扇形結(jié)構(gòu)；CCD乳前牙釉質(zhì)厚度無(wú)明顯變薄，釉板(或裂隙樣)及釉叢結(jié)構(gòu)較多，牙本質(zhì)小管分布及大小不均，部分閉塞，并可見裂隙；觀察CCD恒牙牙根上2／3縱磨片，發(fā)現(xiàn)牙骨質(zhì)較薄，未見明確牙骨質(zhì)細(xì)胞；對(duì)滯留乳牙進(jìn)行觀察，亦未發(fā)現(xiàn)細(xì)胞牙骨質(zhì)。對(duì)CCD患牙

5、以及正常牙的牙釉質(zhì)以及牙本質(zhì)分別進(jìn)行能譜分析，數(shù)據(jù)用SPSS13.0版本進(jìn)行處理，兩樣本均數(shù)t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果表明CCD恒牙的牙釉質(zhì)及牙本質(zhì)的Ca、P含量均較正常降低，并具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(t值分別為29.519、26.998以及9.676、88.982；p值分別為0.001、0.004以及0.011、0.003)，CCD乳牙牙釉質(zhì)的Ca、P含量均降低，并具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(t值分別為33.754、23.412；p值分別為0.011、0.

6、019)，牙本質(zhì)各元素的含量有降低，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，可能是樣本量較少的原因。組織學(xué)分析與能譜分析均表明CCD患牙礦化較差，牙本質(zhì)亦同樣受累。本研究在組織學(xué)水平檢測(cè)了RUNX2基因突變對(duì)CCD患者牙齒結(jié)構(gòu)的影響，再次證明RUNX2基因?qū)τ谘例X正常發(fā)育的重要性。 二、致病基因RUNX2的突變檢測(cè)及對(duì)蛋白亞細(xì)胞定位的影響 對(duì)五個(gè)CCD家系進(jìn)行RUNX2基因突變分析發(fā)現(xiàn)：在五個(gè)CCD家系患者中均檢測(cè)到不同的突變位點(diǎn)，家系中健康成

7、員同一位點(diǎn)均為野生型序列，進(jìn)一步證明RUNX2基因是CCD患者的致病基因，此基因的單倍體不足是CCD的致病原因。其中家系4的c.475G>C錯(cuò)義突變以及家系5的c.1096G>T無(wú)義突變是本研究檢測(cè)到的新突變位點(diǎn)；家系2的c.673C>T以及家系3的c.117lC>G突變位點(diǎn)在中國(guó)CCD患者中首次檢出；家系1的c.674G>A，R225Q是國(guó)外文獻(xiàn)報(bào)道突變率最高的位點(diǎn)。本研究結(jié)果拓展了國(guó)內(nèi)CCD基因?qū)哟蔚难芯款I(lǐng)域，為國(guó)內(nèi)外CCD致病基因

8、的突變位點(diǎn)數(shù)據(jù)庫(kù)增添了新的資料。 為了研究基因突變對(duì)蛋白突變體亞細(xì)胞定位的影響，通過(guò)構(gòu)建真核表達(dá)載體，引入突變位點(diǎn)，轉(zhuǎn)染細(xì)胞，觀察pEGFP-C1-RUNX2載體轉(zhuǎn)染組細(xì)胞的熒光蛋白表達(dá)情況，未引入突變位點(diǎn)的野生型RUNX2組僅在胞核內(nèi)見到綠色熒光表達(dá)；引入突變位點(diǎn)c.674G>A及c.673C>T的兩組轉(zhuǎn)染細(xì)胞，在胞漿及胞核內(nèi)均可見綠色熒光。pCMV-HA-RUNX2載體轉(zhuǎn)染組細(xì)胞，利用熒光免疫組化，引入c.475G>C(pG

9、159R)突變組在胞漿胞核內(nèi)均可見綠色熒光，而野生型僅在胞核內(nèi)有綠色熒光表達(dá)，將轉(zhuǎn)染細(xì)胞分離胞漿胞核蛋白進(jìn)行Westemblot檢測(cè)，可見引入突變組的胞漿胞核成分均具有特異條帶，而野生型僅胞核成分檢測(cè)到特異條帶。我們提出G159R對(duì)于RUNX2蛋白的核定位具有重要作用，推測(cè)G159可能是RUNX2基因新的核定位元件之一，為進(jìn)一步蛋白結(jié)構(gòu)方面的研究提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 三、CCD患者牙髓細(xì)胞的生物學(xué)特性分析及基因差異研究

10、本部分從家系5先證者姐姐的下恒牙中分離培養(yǎng)牙髓細(xì)胞，與正常牙髓細(xì)胞相比，CCD牙髓細(xì)胞比正常細(xì)胞略顯豐滿、扁平；描繪生長(zhǎng)曲線來(lái)評(píng)價(jià)細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)，正常牙髓細(xì)胞生長(zhǎng)趨勢(shì)高于CCD細(xì)胞，流式數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS13.0版本進(jìn)行處理，用了兩樣本均數(shù)t檢驗(yàn)，t值分別為10.14、12.05，兩組細(xì)胞的G1期及S期具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著差異，P值分別為0.001以及0.000，提示CCD細(xì)胞滯留在G1期的比例顯著增多，CCD牙髓細(xì)胞從G1期到S期的過(guò)渡明顯受

11、阻。透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn)CCD細(xì)胞粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張，胞質(zhì)內(nèi)可見大小不等的層板狀小體，這是正常牙髓細(xì)胞所不具有的特殊表現(xiàn)，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張并可見部分核糖體顆粒脫落，可能提示細(xì)胞蛋白合成能力的改變，較多層板狀小體的出現(xiàn)可能與脂類的合成分泌相關(guān)。 對(duì)CCD牙髓細(xì)胞進(jìn)行礦化液誘導(dǎo)，雖然部分細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)長(zhǎng)單極胞漿突起，并呈復(fù)層生長(zhǎng)，但直至培養(yǎng)7周仍無(wú)礦化結(jié)節(jié)形成，而正常牙髓細(xì)胞培養(yǎng)4周后開始有結(jié)節(jié)形成，表明CCD牙髓細(xì)胞的礦化能力減弱，可能提示此細(xì)

12、胞向成牙本質(zhì)樣細(xì)胞分化能力的減弱，以及CCD患者牙髓組織損傷修復(fù)能力減弱。 采用第二代功能分類基因芯片從細(xì)胞水平分析基因突變對(duì)TGF-β／BMP信號(hào)傳導(dǎo)通路相關(guān)基因表達(dá)的影響，發(fā)現(xiàn)有18條基因上調(diào)，14條基因下調(diào)。通過(guò)對(duì)異常表達(dá)基因的分析，提示E366XRUNX2突變體影響了TGF-β／BMP信號(hào)傳導(dǎo)通路上的一些相關(guān)基因的調(diào)控，如Cdc25A、TGFβ2、Smad3、EVI1的表達(dá)下調(diào)，COL3A1、BMP2、4、7均表達(dá)上調(diào)，

13、細(xì)胞的增殖和分化是由多基因多通路共同調(diào)控的，協(xié)同作用較強(qiáng)的某些基因?qū)Q定細(xì)胞最終的趨勢(shì)和命運(yùn)，推測(cè)TGFβ2、Smad3、EVI1的表達(dá)減弱與COL3A1上調(diào)表達(dá)的協(xié)同作用可能阻礙了CCD牙髓細(xì)胞向成牙本質(zhì)細(xì)胞的分化趨勢(shì)；根據(jù)R391X突變體的功能研究報(bào)道，推測(cè)E366X突變極可能影響RUNX2突變體和Smads的相互作用，阻抑BMP對(duì)細(xì)胞分化的作用，BMP2、4、7的上調(diào)表達(dá)可能是由于正常的信號(hào)通路受到影響，通過(guò)其它負(fù)反饋機(jī)制調(diào)控細(xì)胞