中國人Brugada綜合征基因突變K317N的功能表達研究.pdf

1、背景：自從1992年Brugada綜合征被作為一個臨床綜合征提出來后，人們對它的認識日漸深入。Brugada綜合征并不是一個罕見的疾病，在某些國家，其在青年人的致死原因中排名第二位，僅次于交通意外。其靜止心電圖特征表現(xiàn)為右胸導(dǎo)聯(lián)的ST段持續(xù)抬高和完全或者不完全的右束支傳導(dǎo)阻滯，而反復(fù)發(fā)生多形性室性心動過速、心室顫動則是導(dǎo)致心性猝死的重要原因。在臨床心臟病學(xué)研究中，用分子遺傳學(xué)的方法來解釋某些心臟結(jié)構(gòu)正常病人心臟猝死的機制正日益受到重視。

2、近十年的研究表明，編碼人類心臟鈉通道α亞單位的SCN5A基因與Brugada綜合征的發(fā)病機制密切相關(guān)，其原因可能是SCN5A基因的突變造成了心臟鈉通道蛋白的功能障礙。遺傳性鈉通道的缺陷導(dǎo)致動作電位Ⅰ相末內(nèi)向離子流的減弱，Ito占優(yōu)，使動作電位平臺期消失，導(dǎo)致右室跨室壁電壓差(外正內(nèi)負)的形成以及2相復(fù)極不均一，形成了右胸前區(qū)導(dǎo)聯(lián)的ST段抬高及2相折返性室性心律失常的電生理基礎(chǔ)。隨著研究的不斷深入，越來越多的SCN5A基因突變被證實與Br

3、ugada綜合征有關(guān)，其功能表達研究顯示，SCN5A基因突變對人類心臟鈉通道的影響有以下三種：1.鈉通道未能正常表達，導(dǎo)致細胞上鈉通道數(shù)量的減少。2.電壓和時間依賴的鈉通道電流的激活、失活和再激活的異常，主要表現(xiàn)為失活加速、復(fù)活減慢或使其通道處于中間狀態(tài)，導(dǎo)致電流的減少。3.在動作電位的早期，由于鈉通道失活加速導(dǎo)致INa的減少。在先前的研究中，在一個中國人Brugada綜合征家系發(fā)現(xiàn)了SCN5A基因的誤義突變K317N，它位于心臟鈉通道

4、α亞單位SI區(qū)的p-loop區(qū)。而在100個正常對照人群中，沒有發(fā)現(xiàn)類似的基因改變。 目的：為進一步研究Brugada綜合征發(fā)病的離子、細胞電生理機制，擬對首先在中國人Brugada綜合征中發(fā)現(xiàn)的新的SCN5A基因突變(K317N)進行功能表達研究，這就需要正確構(gòu)建攜帶已知基因突變的表達載體。在第一部分中，對鈉通道基因哺乳動物細胞表達重組體pRc/CMV-hH1應(yīng)用PCR法進行定點誘變，以構(gòu)建攜帶有基因突變K317N的pRc/C

5、MV-hH1(K317N)。在第二部分中，運用膜片鉗全細胞記錄技術(shù)對成功轉(zhuǎn)染野生型和突變型SCN5A的293細胞進行電流檢測。 結(jié)論：成功構(gòu)建了攜帶有K317N基因突變的表達重組體pRc/CMV-hH1(K317N)，為進一步進行該突變結(jié)構(gòu)與功能的研究奠定了基礎(chǔ)。大引物誘變法步驟簡單，成功率高，最終通過DNA測序，證明定點誘變過程完全成功。野生型hH1所表達的鈉通道蛋白與正常心肌細胞鈉通道電生理特性相似。而突變型K317N的表達