PRKAG2基因新突變導(dǎo)致中國人PRKAG2心臟綜合征的發(fā)病機(jī)制研究.pdf

1、PRKAG2 G100S是于2007年在一個(gè)中國人心肌肥厚合并傳導(dǎo)異常及心室預(yù)激家系中發(fā)現(xiàn)的一個(gè)新的PRKAG2基因錯(cuò)義突變。該家系患者臨床表現(xiàn)有心肌肥厚(56％)、預(yù)激綜合征(46％)、竇房結(jié)功能不良或高度房室傳導(dǎo)阻滯、猝死，有的還伴有房顫、房撲等房性心律失常，符合國外PRKAG2心臟綜合征家系報(bào)道的共性。經(jīng)過對(duì)該家系成員進(jìn)行PRKAG2基因測(cè)序，發(fā)現(xiàn)PRKAG2基因第3外顯子上出現(xiàn)第100位甘氨酸突變?yōu)榻z氨酸(PRKAG2 G100

2、S)，考慮其可能是導(dǎo)致該家系患者心肌肥厚及傳導(dǎo)系統(tǒng)異常的致病基因，因此我們認(rèn)為PRKAG2 G100S可能導(dǎo)致中國人PRKAG2心臟綜合征的發(fā)生。2001年Gollob等提出PRKAG2心臟綜合征是一種心臟特異的糖原綜合征的假說，認(rèn)為心肌肥厚及心室預(yù)激等臨床表型可能與心肌細(xì)胞內(nèi)的過度糖原累積有關(guān)。此后，有研究認(rèn)為PRKAG2基因可能參與心臟的發(fā)育過程并導(dǎo)致心臟旁道的形成，因此研究人員認(rèn)為應(yīng)從心臟發(fā)育和能量代謝異常的視角了解PRKAG2突

3、變的致病機(jī)制。然而，最近研究發(fā)現(xiàn)心肌糖原累積并不能完全說明心肌肥厚的發(fā)病機(jī)制，AMPK的異?；罨赡苡绊懠?xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑從而導(dǎo)致心肌肥厚。PRKAG2 G100S是首次發(fā)現(xiàn)的一個(gè)導(dǎo)致中國人PRKAG2心臟綜合征的新突變，在國內(nèi)外均未見報(bào)道，其引起家系患者心肌肥厚的致病機(jī)制還不清楚。為明確PRKAG2 G100S突變對(duì)心肌細(xì)胞糖代謝和心肌肥厚標(biāo)志基因表達(dá)的影響，深入認(rèn)識(shí)PRKAG2心臟綜合征的疾病本質(zhì)，本課題通過在SD乳鼠心肌細(xì)胞及I9

4、c2胚胎心肌細(xì)胞中過表達(dá)PRKAG2 G100S突變基因，研究該突變基因是否引起心肌細(xì)胞內(nèi)糖原累積、Ca2+穩(wěn)態(tài)失衡、心肌肥厚標(biāo)志基因表達(dá)增加，初步闡明PRKAG2 G100S新突變引起中國人PRKAG2心臟綜合征的致病機(jī)制。
　　 目的：研究PRKAG2 G100S新突變對(duì)心肌細(xì)胞內(nèi)糖代謝、Ca2+穩(wěn)態(tài)以及心肌肥厚標(biāo)志基因表達(dá)的影響。
　　 方法：(1)攜帶野生型及突變型PRKAG2基因的重組腺病毒載體構(gòu)建：利用Inv

5、itrogen的GatewayTM技術(shù)，通過重疊PCR技術(shù)將目的基因突變體PRKAG2G100S-IRES-EGFP及野生型PRKAG2-IRES-EGFP定向BP重組至入]載體pDONR221上，然后與腺病毒載體pAd/CMV/V5-DEST進(jìn)行LR重組反應(yīng)，形成共表達(dá)目的基因及增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(EGFP)的腺病毒表達(dá)克隆。經(jīng)篩選陽性表達(dá)克隆并測(cè)序驗(yàn)證后，PacI酶切、包裝、擴(kuò)增、純化獲得攜帶EGFP及PRKAG2基因的重組體腺病毒

6、。病毒PCR鑒定并確定病毒滴度。(2)乳鼠心肌細(xì)胞的培養(yǎng)及重組腺病毒感染心肌細(xì)胞：培養(yǎng)乳鼠心肌細(xì)胞，用重組腺病毒感染并使用Westerr blot技術(shù)鑒定PRKAG2蛋白是否在心肌細(xì)胞內(nèi)正確表達(dá)。(3)重組腺病毒感染H92胚胎心肌細(xì)胞及細(xì)胞內(nèi)Ca2+檢測(cè)：用構(gòu)建好的重組腺病毒感染H9c2胚胎心肌細(xì)胞，使用Westernblot技術(shù)鑒定PRKAG2蛋白是否在心肌細(xì)胞內(nèi)正確表達(dá)；以Roth-2/AM為鈣指示劑，使用流式細(xì)胞熒光定量技術(shù)檢測(cè)細(xì)

7、胞內(nèi)Ca2+濃度。(4)重組腺病毒感染乳鼠心肌細(xì)胞及細(xì)胞內(nèi)糖原含量、ANP、α-MHC、β-MHC基因水平檢測(cè)：用構(gòu)建好的重組腺病毒感染SD乳鼠心肌細(xì)胞，使用periodic acid-schiff(PAS)染色檢測(cè)心肌細(xì)胞內(nèi)糖原含量以及使用Real-time qPCR技術(shù)檢測(cè)心房利鈉肽(atrial natriuretic factor,ANP)、β-肌球蛋白重鏈(β-myosin heavy chain,β-MHC)、α-肌球蛋白重

8、鏈(α-myosin heavy chain，α-MHC)mRNA的表達(dá)水平。
　　 結(jié)果：(1)成功構(gòu)建了攜帶EGFP基因的PRKAG2突變體重組腺病毒及野生型重組腺病毒，PCR鑒定結(jié)果表明PRKAG2基因正確插入腺病毒載體。病毒的滴度為：Ad-PRKAG2-IRES-EGFP7.8×108ifu/ml， Ad-PRKAG2 G100S-IRES-EGFP8.4×108ifu/ml。(2)成功培養(yǎng)了SD乳鼠心肌細(xì)胞并建立了過表

9、達(dá)正?；蛲蛔働RKAG2基因的乳鼠心肌細(xì)胞模型；熒光顯微鏡下可見突變體及野生型重組腺病毒感染后的SD乳鼠心肌細(xì)胞表達(dá)EGFP而發(fā)出綠色熒光；Western blot證明PRKAG2蛋白成功在乳鼠心肌細(xì)胞中過表達(dá)。(3)在H9c2胚胎心肌細(xì)胞成功過表達(dá)正?；蛲蛔兊腜RKAG2基因，Western blot證明PRKAG2蛋白過表達(dá)成功;心肌細(xì)胞內(nèi)Ca2+檢測(cè)顯示重組腺病毒感染H9c2胚胎心肌細(xì)胞24-48小時(shí)，突變(GS)組(12.72±

10、7.68)細(xì)胞漿內(nèi)Ca2+濃度與陰性對(duì)照(PK)組(17.28±7.79)、空白對(duì)照(GFP)組(19.33±5.50)組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)；重組腺病毒感染H9c2胚胎心肌細(xì)胞48-72小時(shí)，突變(GS)組(24.18±2.43)細(xì)胞漿內(nèi)Ca2+濃度與陰性對(duì)照(PK)組(26.24±4.77)、空白對(duì)照(GFP)組(26.04±5.71)組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)；重組腺病毒感染H9c2胚胎心肌細(xì)胞48小時(shí)前后

11、，突變(GS)組、陰性對(duì)照(PK)組及空白對(duì)照(GFP)組的細(xì)胞漿內(nèi)Ca2+濃度差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。(4)重組腺病毒感染乳鼠心肌細(xì)胞后，檢測(cè)乳鼠心肌細(xì)胞糖原含量并檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ANP、α-MHC、β-MHC的基因表達(dá)水平。PRKAG2 G100S突變使乳鼠心肌細(xì)胞質(zhì)內(nèi)有明顯糖原累積，而未突變組(陰性對(duì)照(PK)組、空白對(duì)照(GFP)組)糖原累積較少。重組腺病毒感染乳鼠心肌細(xì)胞48-72小時(shí)，突變(GS)組(1.00±0.04)

12、ANP mRNA水平與陰性對(duì)照(PK)組(1.00±0.10)、空白對(duì)照(GFP)組(1.00±0.06)間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)；α-MHC mRNA水平，突變(GS)組(1.00±0.13)與陰性對(duì)照(PK)組(1.00±0.00)、空白對(duì)照(GFP)組(1.05±0.38)組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)；β-MHC mRNA水平，突變(GS)組(1.04±0.33)與陰性對(duì)照(PK)組(1.00±0.04)、空白對(duì)

13、照(GFP)組(1.09±0.53)三組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　 結(jié)論：(1)PRKAG2 G100S未能引起心肌細(xì)胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)失衡，表明Ca2+及其依賴的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑可能未參與心肌肥厚的發(fā)病過程；同時(shí)表明PRKAG2 G100S導(dǎo)致的AMPK活性異常改變可能對(duì)心肌細(xì)胞鈣穩(wěn)態(tài)的影響較小。(2)PRKAG2 G100S未能引起心肌細(xì)胞內(nèi)ANP、α-MHC及β-MHC mRNA水平明顯改變，表明其對(duì)ANP、α-MHC