誘發(fā)遺傳性心臟綜合征的人PRKAG2基因新突變的功能研究.pdf

1、研究背景：PRKAG2心臟綜合征是一種由于編碼單磷酸腺苷激活蛋白激酶γ2亞基的PRKAG2基因遺傳性缺陷導(dǎo)致的罕見的常染色體顯性遺傳病，它的典型表現(xiàn)為：心室預(yù)激，進(jìn)展性傳導(dǎo)系統(tǒng)疾病和心臟肥大。2001年Gollob等首次報(bào)道PRKAG2基因突變與家族性預(yù)激綜合征、傳導(dǎo)系統(tǒng)疾病和心臟肥大有關(guān)，此后陸續(xù)有PRKAG2基因突變與相似家系相關(guān)的報(bào)道。迄今為止，國(guó)內(nèi)外至少在20個(gè)家族性傳導(dǎo)系統(tǒng)異常伴心室預(yù)激及心肌肥厚家系中發(fā)現(xiàn)11種與該疾病發(fā)病有

2、關(guān)的PRKAG2基因突變。我科張靜博士2007年報(bào)道了一個(gè)中國(guó)人大家系，家系的臨床表型符合國(guó)外家系報(bào)道的共性，對(duì)家系成員進(jìn)行PRKAG2基因測(cè)序，在外顯子3上發(fā)現(xiàn)了一個(gè)新的錯(cuò)義突變即第100位甘氨酸突變?yōu)榻z氨酸(G100S)，這個(gè)突變是國(guó)內(nèi)外從來沒有報(bào)道過的，該突變可能導(dǎo)致中國(guó)人PRKAG2心臟綜合征的發(fā)生。目前研究認(rèn)為，PRKAG2心臟綜合征是一種由于AMPK活性紊亂導(dǎo)致糖原沉積的心臟代謝性疾病。國(guó)外報(bào)道的PRKAG2基因突變都出現(xiàn)在

3、胱硫醚β-合成酶(CBS)區(qū)域，突變引起B(yǎng)ateman結(jié)構(gòu)域結(jié)合AMP能力下降從而導(dǎo)致AMPK活性改變。我們發(fā)現(xiàn)的G100S突變，不在國(guó)外報(bào)道的突變位點(diǎn)之列，相反，既往國(guó)外報(bào)道的這些位點(diǎn)測(cè)序完全正常，該突變并不位于CBS區(qū)域，其引起家系患者心肌肥厚的致病機(jī)制還不清楚。為了驗(yàn)證G100S突變?cè)谥袊?guó)人PRKAG2心臟綜合征家系中的致病作用，我們通過在斑馬魚中過表達(dá)PRKAG2突變基因，研究G100S突變對(duì)基因表達(dá)、AMPK活性、糖原代謝及心

4、臟肥大的影響，考察G100S新突變的功能，在整體動(dòng)物水平證實(shí)該突變的功能意義，同時(shí)加深對(duì)PRKAG2基因非CBS區(qū)域的功能了解，初步闡明G100S新突變引起中國(guó)人PRKAG2心臟綜合征的致病機(jī)制。
　　 目的：研究基因PRKAG2G100S新突變的功能，探討該突變?cè)谥袊?guó)人家族性傳導(dǎo)系統(tǒng)異常伴心室預(yù)激及心肌肥厚家系中的發(fā)病機(jī)制。
　　 方法：(1)斑馬魚心肌特異性啟動(dòng)子vmhc的克隆及功能鑒定：從斑馬魚組織中抽提斑馬魚基因

5、組DNA，應(yīng)用PCR技術(shù)克隆得到斑馬魚心肌特異性肌球蛋白重鏈(ventricular myosin heavy chain，vmhc)啟動(dòng)子基因功能片段序列，構(gòu)建啟動(dòng)子vmhc驅(qū)動(dòng)的增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(Enhanced Green Fluorescent Protein，EGFP)表達(dá)載體，應(yīng)用PCR技術(shù)克隆得到vmhc驅(qū)動(dòng)的增強(qiáng)型綠色熒光蛋白基因片段，通過顯微注射技術(shù)將外源基因?qū)氚唏R魚受精卵，觀察其在斑馬魚心肌中的表達(dá)特性及特異性。

6、(2)vmhc驅(qū)動(dòng)的人PRKAG2野生型及突變型基因表達(dá)載體的構(gòu)建：應(yīng)用Trizol法抽提健康人全血mRNA，RT-PCR克隆人野生型PRKAG2基因，繼而構(gòu)建重組載體pEGFP-PRKAG2；通過PCR定點(diǎn)突變的方法構(gòu)建人突變型PRKAG2基因重組載體pEGFP-G100S和pEGFP-R302Q，應(yīng)用酶切連接的方法得到重組載體pEGFP-vmhc-WT、pEGFP-vmhc-G100S和pEGFP-vmhc-R302Q，最后應(yīng)用搭橋

7、PCR方法引入HA標(biāo)簽。(3)人PRKAG2野生型及突變型基因在斑馬魚中的實(shí)驗(yàn)研究：通過PCR擴(kuò)增得到vmhc-WT/G100S/R302Q-HA基因片段，應(yīng)用顯微注射技術(shù)將上述外源基因片段導(dǎo)入斑馬魚受精卵，并以R302Q為陽性對(duì)照，野生型WT為陰性對(duì)照，未顯微注射外源基因的斑馬魚胚胎為空白對(duì)照，分別進(jìn)行real-timePCR驗(yàn)證PRKAG2基因表達(dá)，WesternBlot驗(yàn)證PRKAG2蛋白表達(dá)，斑馬魚心臟組織學(xué)檢查，PAS染色檢測(cè)

8、心肌糖原含量，比色法定量檢測(cè)AMPK活性。
　　 結(jié)果：(1)正確克隆了vmhc啟動(dòng)子基因功能片段序列(1952bp)，通過顯微注射技術(shù)將包含vmhc啟動(dòng)子序列，EGFP序列及3’UTR序列的基因片段導(dǎo)入斑馬魚受精卵，熒光顯微鏡下在斑馬魚心臟區(qū)域觀察到綠色熒光。通過RT-PCR擴(kuò)增EGFP基因及western-blot檢測(cè)EGFP蛋白，驗(yàn)證了外源EGFP基因及蛋白在斑馬魚中的成功表達(dá)。(2)正確克隆了人野生型PRKAG2基因，成

9、功構(gòu)建了重組載體HA-vmhc-WT、HA-vmhc-G100S和HA-vmhc-R302Q。(3)應(yīng)用顯微注射技術(shù)將vmhc-WT/G100S/R302Q-HA基因片段分別導(dǎo)入斑馬魚受精卵，通過對(duì)各組斑馬魚的Real-timePCR檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)注射有外源基因片段的斑馬魚有PRKAG2基因的表達(dá)，而未注射有外源基因片段的對(duì)照組斑馬魚沒有PRKAG2基因的表達(dá)，表明vmhc啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)WT、GS、RQ基因成功在斑馬魚中表達(dá)。進(jìn)一步通過分析PR

10、KAG2基因與內(nèi)參actin的CT值，提示三個(gè)外源基因表達(dá)水平的高低為：WT>GS>RQ。通過對(duì)各組斑馬魚HA的表達(dá)量的WesternBlot檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)未注射基因片段的對(duì)照組無HA蛋白表達(dá)，而注射有外源基因片段的各實(shí)驗(yàn)組均有HA蛋白表達(dá)，RQ組的蛋白表達(dá)最弱，GS組稍弱于WT組，說明vmhc啟動(dòng)子可以驅(qū)動(dòng)WT、GS、RQ三個(gè)基因型在斑馬魚中的蛋白表達(dá)，但G100S突變與R302Q突變阻礙了PRKAG2蛋白在斑馬魚中的正常表達(dá)，G100S

11、突變的阻礙作用要弱于R302Q突變。通過比較各組斑馬魚心臟連續(xù)切片中最厚處心壁厚度，結(jié)果顯示：GS組(14.71±1.97μm)心壁厚度顯著大于control組(11.74±1.86μm)(P=0.021)和WT組(11.81±2.09μm)(P=0.024)，RQ組(17.94±2.30μm)心壁厚度顯著大于GS組(P=0.014)，提示G100S突變和R302Q突變會(huì)引起斑馬魚心臟肥厚。通過對(duì)各組斑馬魚心臟切片PAS法染色，發(fā)現(xiàn)WT

12、、GS、RQ組斑馬魚心壁糖原沉積較control組增多。通過檢查各組斑馬魚組織AMPK活性，結(jié)果顯示：GS組(0.046213±0.001501μmolNADH/min/mg)和RQ組(0.022037±0.001228μmolNADH/min/mg)AMPK活性顯著低于control組(0.06257±0.000935μmolNADH/min/mg)(P=0.000)和WT組(0.084877±0.001879μmolNADH/min

13、/mg)(P=0.000)，GS組AMPK活性顯著高于RQ組(P=0.000)，WT組AMPK活性顯著高于control組(P=0.000)。
　　 結(jié)論：(1)PRKAG2G100S突變導(dǎo)致了PRKAG2基因功能發(fā)生改變，驗(yàn)證了G100S突變是中國(guó)人PRKAG2心臟綜合征家系的發(fā)病原因，證實(shí)了G100S突變導(dǎo)致AMPK活性降低及糖原累積是中國(guó)人PRKAG2心臟綜合征家系的發(fā)病機(jī)制。(2)位于PRKAG2基因非CBS區(qū)域的G10