腫瘤細(xì)胞中長(zhǎng)非編碼RNA PRKAG2-AS1調(diào)控PRKAG2基因表達(dá)的機(jī)制研究.pdf

1、長(zhǎng)鏈非編碼RNA（1ong non-coding RNA，lncRNA）是真核細(xì)胞中一類長(zhǎng)度超過(guò)200 nt，不具有蛋白編碼功能的RNA分子。目前研究表明，lncRNA可以在轉(zhuǎn)錄水平、轉(zhuǎn)錄后修飾和翻譯水平調(diào)節(jié)基因的表達(dá)，從而調(diào)控包括染色體劑量補(bǔ)償、染色質(zhì)修飾、神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育和器官形成等一系列重要的細(xì)胞生理及組織發(fā)育過(guò)程。研究發(fā)現(xiàn)，lncRNAs與包括癌癥在內(nèi)的多種人類復(fù)雜疾病的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切。然而，目前只有極少數(shù) lncRNAs被研究，

2、而絕大多數(shù)lncRNAs的功能尚未知。因此，深入研究 lncRNA在疾病發(fā)生發(fā)展中的功能作用可為人類復(fù)雜疾病的診斷和治療提供新的研究基礎(chǔ)和理論依據(jù)。
　　AMPK是一種真核細(xì)胞生物中廣泛存在的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，可直接或間接影響各種下游信號(hào)通路，調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激、細(xì)胞自噬、細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞極性、線粒體功能和基因毒性反應(yīng)，影響細(xì)胞和組織生理機(jī)能。AMPK是由α、β、γ亞基組成的異源三聚體蛋白。其中α亞基是功能催化亞基，

3、其第172位蘇氨酸殘基磷酸化是AMPK激酶活化的標(biāo)志；β亞基主要起支撐和連接作用；γ亞基是主要的活性調(diào)節(jié)亞基，具有ATP/AMP結(jié)合位點(diǎn)。當(dāng)AMP與γ亞基結(jié)合后，導(dǎo)致該亞基以及AMPK空間結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，使α亞基第172位蘇氨酸暴露并磷酸化，從而提高并維持 AMPK的活性。作為細(xì)胞代謝的重要節(jié)點(diǎn)分子，AMPK在細(xì)胞內(nèi)調(diào)節(jié)能量平衡及維持AMP/ATP濃度方面起關(guān)鍵作用，因此，其活性調(diào)節(jié)方式及機(jī)制一直是該酶研究的關(guān)鍵和熱點(diǎn)。
　　結(jié)合課

4、題組在lncRNA表觀遺傳調(diào)控方面的研究理論和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)以及課題組人員對(duì)AMPK的研究，我們分析發(fā)現(xiàn)，調(diào)控AMPK活性的γ2亞基的編碼基因PRKAG2（protein kinase，AMP-activated，gamma2 non-catalytic subunit）的反義鏈上存在 lncRNA轉(zhuǎn)錄本PRKAG2-AS1，與PRKAG2是典型的頭對(duì)頭轉(zhuǎn)錄模式，這與課題組報(bào)道的反義轉(zhuǎn)錄本AS1DHRS4與其正義基因DHRS4的結(jié)構(gòu)和轉(zhuǎn)錄方式

5、非常相似。這一結(jié)構(gòu)上的特點(diǎn)提示：PRKAG2-AS1可能與AS1DHRS4一樣通過(guò)表觀遺傳學(xué)的方式參與正義基因PRKAG2的表達(dá)調(diào)控，進(jìn)而影響AMPK激酶活性。
　　我們首先運(yùn)用RACE技術(shù)，在HeLa細(xì)胞株中克隆并鑒定了PRKAG2-AS1的轉(zhuǎn)錄本序列。RNAi沉默PRKAG2-AS1后，分別運(yùn)用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)和蛋白質(zhì)印跡技術(shù)檢測(cè)PRKAG2的mRNA和蛋白的表達(dá)水平，結(jié)果顯示PRKAG2的mRNA和蛋白水平均降低。此結(jié)果證

6、實(shí)lncRNA PRKAG2-AS1可以影響其正義基因PRKAG2的表達(dá)。隨后通過(guò)ChIP實(shí)驗(yàn)我們發(fā)現(xiàn)，RNAi沉默PRKAG2-AS1表達(dá)后，PRKAG2基因啟動(dòng)子區(qū)域的組蛋白去乙酰化酶HDAC和組蛋白甲基化酶G9a的富集水平升高，使PRKAG2基因啟動(dòng)子區(qū)域的組蛋白乙?；浇档?、H3K27me3水平升高，從而抑制PRKAG2基因轉(zhuǎn)錄。
　　基于本研究發(fā)現(xiàn)的PRKAG2-AS1對(duì)PRKAG2基因的調(diào)控作用以及AMPK在腫瘤細(xì)胞

7、中的重要作用，我們進(jìn)一步檢測(cè)并對(duì)比了PRKAG2-AS1和PRKAG2在正常/癌細(xì)胞和正常/腫瘤組織中的 RNA表達(dá)水平。通過(guò)對(duì)比癌細(xì)胞（HeLa/HepG2）和正常細(xì)胞（HEK293/HL-7702）、腫瘤組織（結(jié)腸癌/肝癌）和正常組織（結(jié)腸/肝）中的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)在腫瘤組織和癌細(xì)胞中PRKAG2-AS1和PRKAG2的表達(dá)量均低于相應(yīng)的正常組織和細(xì)胞。已有文獻(xiàn)報(bào)道AMPK在腫瘤細(xì)胞中的活性較低，因此我們推測(cè)在腫瘤細(xì)胞中l(wèi)ncRNA可

8、能通過(guò)影響PRKAG2的表達(dá)從而影響AMPK的活性，進(jìn)而在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮作用。而lncRNA PRKAG2-AS1對(duì)腫瘤細(xì)胞生理的影響，還有待于我們今后進(jìn)一步的研究證實(shí)。
　　綜上所述，我們認(rèn)為：1、在HeLa細(xì)胞中PRKAG2-AS1表達(dá)可影響PRKAG2基因的mRNA水平和蛋白水平。2、PRKAG2-AS1的水平降低可通過(guò)影響PRKAG2基因啟動(dòng)子區(qū)域的組蛋白去乙?；窰DAC和組蛋白甲基化酶G9a的富集水平，使PR