子宮頸癌中長鏈非編碼RNA差異表達(dá)譜分析.pdf

1、背景和目的:
　　子宮頸癌是女性惡性腫瘤，其發(fā)病率在女性生殖道腫瘤中高居首位，每年新發(fā)病例約52.9萬，死亡病例27.5萬，約85％發(fā)生在發(fā)展中國家[1]。近幾年，我國子宮頸癌的發(fā)病率有明顯上升及年輕化的趨勢，發(fā)病率以每年2%~3%的速度增長。子宮頸癌治療后復(fù)發(fā)50%發(fā)生在一年內(nèi)，75%~80%發(fā)生在2年內(nèi)，嚴(yán)重影響著宮頸癌患者的生存時間。臨床常規(guī)物理診斷手段(如核磁共振、超聲等)發(fā)現(xiàn)小于1cm的微小病灶很難，而傳統(tǒng)腫瘤標(biāo)志物的靈

2、敏度和特異性也不夠高；患者常因非個體化治療遭受多次不必要的放化療痛苦，故臨床上子宮頸癌診斷和治療最迫切的問題還在于缺乏早期診斷和監(jiān)測疾病復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移、判斷預(yù)后以及指導(dǎo)個體化治療的可靠指標(biāo)。
　　長鏈非編碼RNA（long noncoding RNA，lncRNA）是非編碼RNA中的一種類型，即國際上認(rèn)定的一種長度大于200個核苷酸的 RNA轉(zhuǎn)錄本（基于 RNA的分離及提取程序以200個核苷酸劃界）[2]，不具有編碼蛋白質(zhì)的功能，主要

3、作為誘餌分子、引導(dǎo)分子、骨架分子及增強(qiáng)子參與多種調(diào)控機(jī)制[3]，在轉(zhuǎn)錄水平、轉(zhuǎn)錄后水平以及表觀遺傳水平（如染色質(zhì)重塑、組蛋白修飾）調(diào)控基因表達(dá)。大多數(shù)lncRNA含有高度保守的近端啟動子序列、外顯子、內(nèi)含子及二級結(jié)構(gòu)，這意味著lncRNA不是基因轉(zhuǎn)錄中的“噪音”[4]，相反，lncRNA在細(xì)胞周期改變、增殖、遷移和代謝等方面發(fā)揮了重要作用[5,6,7]。近年來，隨著全基因組微陣列及高通量測序技術(shù)的快速發(fā)展及廣泛應(yīng)用，人類基因組內(nèi)越來越多

4、的lncRNA被鑒定出來，lncRNA所介導(dǎo)的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)調(diào)控著數(shù)量眾多的編碼基因，因此，lncRNA在腫瘤學(xué)研究中具有重要意義，尋找lncRNA分子及其靶基因的研究，已成為基因調(diào)控和腫瘤學(xué)研究領(lǐng)域的熱點及重要分支。
　　基因表達(dá)譜分析是指通過構(gòu)建處于某一特定狀態(tài)下的細(xì)胞或組織的非偏性cDNA文庫，經(jīng)基因芯片進(jìn)行大規(guī)模cDNA測序，從而描繪該特定細(xì)胞或組織在特定狀態(tài)下的基因表達(dá)種類和豐度信息，這樣編制成的數(shù)據(jù)表就稱為基因表達(dá)譜。基因芯

5、片技術(shù)是目前研究lncRNA表達(dá)譜的一種理想有效的方法，已廣泛應(yīng)用于多種腫瘤相關(guān)的lncRNA差異表達(dá)譜分析，例如，骨肉瘤差異表達(dá)譜，乙肝相關(guān)性肝癌差異表達(dá)譜等分析。研究腫瘤基因表達(dá)譜、選取信息基因是從信息學(xué)角度出發(fā)尋找腫瘤相關(guān)基因、發(fā)現(xiàn)腫瘤基因表達(dá)特征的直接手段。
　　目前，有關(guān)lncRNA與宮頸癌的研究，國內(nèi)外主要是通過檢測某些已經(jīng)研究較成熟的 lncRNAs在宮頸癌及其細(xì)胞系中表達(dá)水平上的差異，及該差異與臨床病理因素的關(guān)系來

6、得出它們與宮頸癌發(fā)生發(fā)展相關(guān)，少數(shù)對小樣本進(jìn)行芯片檢測，表明宮頸癌發(fā)生發(fā)展過程中存在與疾病相關(guān)的lncRNAs，但由于其采用芯片含蓋lncRNA數(shù)據(jù)不全面及檢測樣本量少，缺乏代表性，尚未研究出有臨床診斷及治療價值的lncRNA分子。
　　本課題采用博奧生物集團(tuán)有限公司提供的一款涵蓋 lncRNA序列最新最全面的lncRNA芯片——晶芯4x180k lncRNA V3.0檢測芯片，在14對宮頸鱗癌組織及其相應(yīng)癌旁正常組織中檢測lnc

7、RNA基因差異表達(dá)譜，其目的意義在于：從基因水平尋找病因，分析宮頸癌中l(wèi)ncRNA基因表達(dá)特征，發(fā)現(xiàn)與宮頸鱗癌致病過程相關(guān)的lncRNAs，為今后靶l(wèi)ncRNA基因的篩選縮小范圍，為lncRNA進(jìn)一步功能及作用機(jī)制的研究奠定基礎(chǔ)，從而最終尋找出宮頸癌中特有的新的生物學(xué)標(biāo)志物，探索出新的診斷與治療途經(jīng)。
　　材料與方法:
　　一.檢測子宮頸癌組織與其相應(yīng)癌旁正常組織lncRNA差異表達(dá)譜
　?、狈謩e取14例子宮頸鱗癌組織

8、和相應(yīng)癌旁正常組織，病理快速冰凍確定分組，用Trizol試劑法提取總RNA，用NanoDropND-2000型紫外分光光度計、甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳法及 Aglient2100生物芯片分析儀進(jìn)行提取RNA質(zhì)量檢測。
　　⒉質(zhì)量檢測合格后，在博奧生物集團(tuán)有限公司暨生物芯片北京國家工程研究中心的協(xié)助下，采用由該公司提供的晶芯4x180k lncRNA V3.0檢測芯片進(jìn)行雜交反應(yīng)，經(jīng)過Agilent芯片掃描儀（G2565CA）掃描后得

9、到原始數(shù)據(jù)，原始數(shù)據(jù)由該公司經(jīng) Agilent Feature Extraction(v10.7)軟件對雜交圖片進(jìn)行分析并提取數(shù)據(jù)，然后使用 Agilent GeneSpring軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行歸一化和差異分析，計算基因表達(dá)差異和統(tǒng)計學(xué)顯著性P值。本課題所采用芯片是博奧公司借助Agilent芯片制備平臺推出的一款 lncRNA芯片，以 GENCODE/ENSEMBL最新版本的22444條序列信息為基礎(chǔ)，整合了 Refseq、UCSC、H-

10、InvDB、Human lincRNA catalog、NRED、lncRNAdb、RNAdb等13個主要lncRNA數(shù)據(jù)庫及相關(guān)文獻(xiàn)報道的序列，同時也包含中科院生物物理所陳潤生院士研究組發(fā)現(xiàn)的約848條中等長度的非編碼RNA，是目前涵蓋 lncRNA序列最新最全面的一款芯片，并且可同時對mRNA進(jìn)行檢測，包括約3.7萬條lncRNA和約3.4萬條mRNA檢測的探針。該芯片采用Agilent原位合成方式，設(shè)計為60mer的長寡核苷酸探針

11、，檢測探針均重復(fù)2次或以上，兼顧高嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件下高靈敏度及高特異性檢測效果，性價比高。
　?、骋訤olgchange值>2，并且P≤0.05作為差異基因納入標(biāo)準(zhǔn)，采用折疊倍率(Fold Change)法進(jìn)行差異基因篩選，獲得差異lncRNAs和mRNAs表達(dá)譜，通過散點圖(Scatter Plot)和火山圖(Volcano Plot)對差異lncRNAs和mRNAs進(jìn)行直觀標(biāo)示，然后再采用Cluster3.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行聚類分析

12、；
　　二.SYBR GREEN I實時熒光定量PCR驗證lncRNAs差異表達(dá)譜
　　從差異表達(dá)倍數(shù)前20、基因表達(dá)量前20的 lncRNA差異表達(dá)譜中，選取lncRNA基因中含有內(nèi)含子的9個lncRNAs，其中上調(diào)lncRNA4個：uc001ysg.1， ENST00000558982.1，ENST00000444286.1，ENST00000460164.1，下調(diào)lncRNA5個：ENST00000418923.1，

13、ENST00000502334.1， ENST00000537998.1， ENST00000414515.2，uc009zbb.1，采用 SYBR GREEN I實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(real-time fluorescent quantitative PCR，RT-PCR)在隨機(jī)選取的5對組織樣本中進(jìn)行驗證，并用GAPDH做內(nèi)參，進(jìn)一步明確lncRNA基因芯片的準(zhǔn)確性。結(jié)果
　?、弊訉m頸癌癌灶組織與相應(yīng)癌旁正常組織相比，在

14、檢測的lncRNA表達(dá)譜中，差異 lncRNAs有1457個，其中平均上調(diào)的 lncRNAs有694個，平均下調(diào)的lncRNAs有763個，uc001ysg.1是上調(diào)倍數(shù)最大的lncRNA，上調(diào)倍數(shù)為8.337529， ENST00000418923.1是下調(diào)倍數(shù)最大的 lncRNA，下調(diào)倍數(shù)為6.6592875；同時檢測所得的差異mRNAs共有2223個，其中平均上調(diào)的mRNAs有1624個，平均下調(diào)的mRNAs有599個，NM_00

15、5733是上調(diào)倍數(shù)最大的mRNA，上調(diào)倍數(shù)為9.013323，NM_001242607是下調(diào)倍數(shù)最大的mRNA，下調(diào)倍數(shù)為6.6107173。
　　⒉實時熒光定量PCR結(jié)果顯示uc001ysg.1（P=0.04），ENST00000558982.1（P=0.031），ENST00000444286.1（P=0.035），ENST00000460164.1（P=0.025）這4個基因表達(dá)顯著上調(diào), ENST00000418923.1

16、（P=0.012），ENST00000502334.1（P=0.025），ENST00000537998.1（P=0.043），ENST00000414515.2（P=0.013）， uc009zbb.1（P=0.007）這5個基因表達(dá)顯著下調(diào)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），和芯片結(jié)果基本吻合。
　　結(jié)論:
　　1.晶芯lncRNA V3.0芯片是檢測子宮頸癌差異表達(dá)基因的一種快速、高效、高通量的檢測手段；
　　

17、2.芯片結(jié)果表明在子宮頸癌中存在異常表達(dá)的lncRNA基因，利用實時熒光定量 PCR對芯片結(jié)果進(jìn)行驗證，進(jìn)一步提高了芯片結(jié)果的可信度，說明這些lncRNAs參與了宮頸癌多種惡性表型的調(diào)控過程；
　　3.表達(dá)譜中 uc001ysg.1、ENST00000558982.1、ENST00000444286.1、ENST00000460164.1、ENST00000418923.1、ENST00000502334.1、ENST000005