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文檔簡介
1、背景: PRKAG2心臟綜合征主要臨床表型為:心肌肥厚、心室預激以及逐步進展的心臟傳導系統(tǒng)病變,是一種少見的常染色體顯性遺傳性疾病,主要由于編碼激活腺苷-磷酸的蛋白激酶(AMP-activated protein kinase,AMPK)γ2調(diào)節(jié)亞單位的PRKAG2基因發(fā)生突變。AMPK廣泛存在于哺乳動物的組織中,被稱為“細胞能量調(diào)節(jié)器”,通過調(diào)節(jié)葡萄糖和脂質(zhì)代謝維持細胞內(nèi)能量平衡,是由催化亞基α和調(diào)節(jié)亞基β、γ三個亞單位組成的異源三聚
2、體蛋白,γ2亞基包含4個由60個氨基酸組成的胱硫醚β-合成酶(CBS)區(qū)域,它們串聯(lián)形成Bateman結(jié)構(gòu)域。Bateman結(jié)構(gòu)域結(jié)合AMP能力變化能引起AMPK活性改變,從而改變細胞能量代謝和平衡。截止目前,國際上報道了不少于20個位于常染色體7q3上AMPKγ2亞基突變的PRKAG2心臟綜合征家系,共有11種PRKAG2基因突變,并證實所有的突變都集中在γ2亞基的CBS區(qū)域,導致該區(qū)域的Bateman結(jié)構(gòu)域結(jié)合AMP能力降低從而導致
3、以上典型的PRKAG2心臟綜合征癥狀。長海醫(yī)院心內(nèi)科的張靜博士于2007年首次報道了漢人特有的PRKAG2心臟綜合征家系并進行了跟蹤基因測序,此家系同樣具有國外報道家系的共性:心肌肥厚、預激綜合征,高度房室傳導阻滯和竇房結(jié)功能不良、猝死以及房撲、房顫等房性心率失常等。但不同于以往所有報道的位于CBS區(qū)的突變,我們測序發(fā)現(xiàn)的G100S突變位點位于非CBS區(qū)的外顯子3上,而國外報道的所有位點測序完全正常。是否位于非CBS區(qū)域的G100S突變
4、與位于CBS區(qū)的突變位點一樣能引起AMPK功能的改變,其導致AMPK功能改變的生物學效應和CBS區(qū)的突變比較是否一致,為此前期課題組已經(jīng)做了相關(guān)的研究:在離體細胞水平證明了此基因突變可引起動作電位的改變,初步探討了此突變引起心律失常的機制;在魚類水平上,證明了G100S突變可引起心臟肥大,并探討了其相關(guān)機制。鑒于斑馬魚模型不能行心電圖檢查,不能在癥狀方面進行心律失常的鑒定,故目前在心律失常方面研究存在不足,為進一步研究G100S突變在整
5、體哺乳動物水平是否引起心肌肥大及心律失常,其致病機制如何,轉(zhuǎn)基因小鼠模型具有無可比擬的優(yōu)勢。課題組通過構(gòu)建和人基因同源性更接近的哺乳類動物的轉(zhuǎn)基因模型進行深入研究。而此次構(gòu)建的過表達PRKAG2(G100S)突變的轉(zhuǎn)基因小鼠模型,通過對其癥狀表型的觀察及作用機制深入研究,有助于加深對AMPKγ2亞基非CBS區(qū)域功能的認識,對全面研究此突變位點在漢人PRKAG2心臟綜合征家系中的臨床表型及其機制具有至關(guān)重要的作用和價值。并可能為以后治療這
6、一中國人特有的PRKAG2心臟綜合癥提供全新的思路。
目的:本研究通過構(gòu)建PRKAG2(G100S)轉(zhuǎn)基因小鼠模型,觀察其心肌肥大和心律失常等表型,并進一步探討和研究新突變G100S在PRKAG2心臟綜合征中導致心肌肥大和心律失常致病機理。
方法:(1) PRKAG2(G100S)轉(zhuǎn)基因小鼠模型的構(gòu)建:我們選擇心臟特異表達的小鼠Myh6(α-MHC)基因啟動子驅(qū)動PRKAG2(G100S)表達,通過分子克隆將PRKA
7、G2(G100S)片段與Myh6(α-MHC)Promoter及polyA連接,并在兩側(cè)添加用于穩(wěn)定表達的insulator元件。使用轉(zhuǎn)基因片段最外側(cè)的內(nèi)切酶釋放轉(zhuǎn)基因片段,通過原核注射技術(shù)將轉(zhuǎn)基因DNA片段注射至小鼠受精卵原核內(nèi),將注射后的受精卵移植到假孕雌鼠輸卵管中,雌鼠妊娠并產(chǎn)仔后,剪小仔尾尖抽提基因組DNA進行PCR鑒定,確認攜帶轉(zhuǎn)入基因片段的轉(zhuǎn)基因鼠。獲得的轉(zhuǎn)基因首建鼠(founder)與野生型C57BL/6J小鼠回交,取其轉(zhuǎn)
8、基因陽性的后代,應用qPCR技術(shù)及Western Blot-蛋白質(zhì)印跡技術(shù)確認轉(zhuǎn)入基因在心臟高表達。并將轉(zhuǎn)基因小鼠心臟提取的RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA,測序明確突變基因G100S在心臟表達。(2) PRKAG2(G100S)轉(zhuǎn)基因小鼠模型心肌肥大表型及其機制研究:以同窩野生型小鼠(WT)為陰性對照組,PRKAG2(G100S)轉(zhuǎn)基因小鼠(TG)為實驗組,應用超聲檢測轉(zhuǎn)基因小鼠和同窩野生型小鼠的心臟,明確其有無心臟肥大;通過稱量小鼠心臟干重和
9、體重,明確心重/體重比值有無統(tǒng)計學意義;通過心臟HE染色等組織病理學檢查明確轉(zhuǎn)基因小鼠心臟肥大的組織學表現(xiàn);應用PAS染色明確轉(zhuǎn)基因小鼠心肌細胞內(nèi)有無糖原沉積;應用AMPK試劑盒檢測技術(shù),明確突變基因G100S在轉(zhuǎn)基因小鼠心肌細胞內(nèi)的活性如何改變。(3)PRKAG2(G100S)轉(zhuǎn)基因小鼠模型心律失常表型及其機制研究:心電圖檢測轉(zhuǎn)基因小鼠有無心律失常表型;通過共聚焦技術(shù)檢測急性分離的成年轉(zhuǎn)基因小鼠心肌細胞,明確其細胞內(nèi)的鈣離子穩(wěn)態(tài)有無改
10、變。
結(jié)果:(1)成功構(gòu)建了含有此突變基因的載體序列,并應用原核注射技術(shù)成功構(gòu)建了PRKAG2 G100S轉(zhuǎn)基因小鼠模型,通過qPCR和Western Blot技術(shù)驗證了在F2代的轉(zhuǎn)基因小鼠的心臟上,此突變基因能穩(wěn)定傳代并穩(wěn)定高表達;(2)通過超聲結(jié)果顯示(WT vs TG): IVS-d(0.858±0.081 vs.1.31±0.216 mm,n=6,p<0.01),IVS-s(1.211±0.184 vs.1.695±0
11、.144 mm,n=6,p<0.01),LVPW-d(0.687±0.114 vs.1.063±0.159mm, n=6, p<0.01), LVPW-S(1.013±0.108 vs.1.370±0.083 mm, n=6, p<0.01) and LVMass(94.11±7.25 vs.193.23±54.41 g,n=6,p<0.01),證實了PRKAG2 G100S轉(zhuǎn)基因小鼠有心肌肥大的表型;HE染色證實了其心肌細胞排列紊亂,
12、心肌細胞上有壞死的液泡等組織學表現(xiàn);PAS染色明確了轉(zhuǎn)基因小鼠心肌細胞內(nèi)糖原大量沉積;AMPK試劑盒檢測技術(shù)分別檢測野生型和轉(zhuǎn)基因型心臟組織,結(jié)果為n=3,P=0.0046,顯示有統(tǒng)計學差異,證實了突變基因G100S在轉(zhuǎn)基因小鼠相比同窩野生型小鼠心肌細胞內(nèi)的活性降低。(3)心電監(jiān)測暫未觀察到小鼠心律失常,但通過共聚焦線掃,在138S內(nèi)鈣波的個數(shù)統(tǒng)計結(jié)果顯示W(wǎng)T vs TG(1.2±1.316 vs6.3±2.312個,n=10,P<0.
13、01),證實突變基因能引起心臟細胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)的改變。
結(jié)論:本課題成功構(gòu)建了PRKAG2(G100S)過表達的轉(zhuǎn)基因小鼠模型,證實了此G100S突變基因可以引起轉(zhuǎn)基因小鼠的心臟肥大,其致病機制同目前報道的CBS區(qū)的突變致病機理一致,通過降低AMPK活性,引起心肌細胞內(nèi)糖原沉積,最終導致心肌肥大。心律失常的心電圖表型盡管未能觀測到,但隨后應用共聚焦對轉(zhuǎn)基因小鼠急性分離的心肌細胞進行破膜檢測,發(fā)現(xiàn)其細胞內(nèi)鈣離子穩(wěn)態(tài)發(fā)生了改變,證明我
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