馬凡綜合征和支氣管擴(kuò)張致病突變研究.pdf

1、本文主要從以下幾部分進(jìn)行論述：
　　研究?jī)?nèi)容一 125例中國(guó)馬凡綜合征患者致病基因突變篩查
　　馬凡綜合征(Marfan syndrome，MFS)是一種常染色體顯性遺傳的結(jié)締組織病，在人群中發(fā)病頻率為1/3000-1/5000。通過(guò)高通量測(cè)序?qū)FS相關(guān)基因FBN1、TGFBR1、TGFBR2進(jìn)行檢測(cè)，是對(duì)患者進(jìn)行明確診斷，指導(dǎo)手術(shù)及藥物治療的有效手段。
　　目的:繪制中國(guó)MFS人群突變譜;進(jìn)行中國(guó)MFS基因型表型關(guān)

2、聯(lián)分析;為中國(guó)MFS患者提供明確診斷、指導(dǎo)治療、預(yù)后評(píng)估及遺傳咨詢;對(duì)未篩查到致病變異的家系進(jìn)行全外顯子組測(cè)序(WES)以期發(fā)現(xiàn)新的可能致病基因。
　　方法:1.研究對(duì)象:125例中國(guó)MFS患者及家系成員;2.研究方法:(1)高通量二代測(cè)序:通過(guò)Ion torrent測(cè)序平臺(tái)對(duì)125例患者進(jìn)行靶基因測(cè)序，測(cè)序Panel（靶基因引物庫(kù)）中包含3個(gè)明確的MFS致病基因;對(duì)二代測(cè)序結(jié)果進(jìn)行篩選;并對(duì)所篩選到的結(jié)果進(jìn)行Sanger測(cè)序驗(yàn)證

3、;(2)家系分析:對(duì)通過(guò)Ion torrentPGM測(cè)序未發(fā)現(xiàn)疑似致病變異的有家族史的患者進(jìn)行了STR marker家系連鎖分析，確定連鎖區(qū)域。對(duì)致病基因連鎖在FBN1基因的家系，進(jìn)行FBN1基因重測(cè)序或整個(gè)FBN1基因測(cè)序;對(duì)于FBN1基因不連鎖的家系，進(jìn)行全外顯子組測(cè)序分析，以期發(fā)現(xiàn)新的致病基因。對(duì)一個(gè)類馬凡的雙胞胎家系進(jìn)行全外顯子組測(cè)序分析。(3)MLPA檢測(cè)大片段插入/缺失突變:對(duì)未發(fā)現(xiàn)致病變異患者進(jìn)行多重連接依賴式探針擴(kuò)增技術(shù)

4、(MLPA)檢測(cè)患者是否攜帶FBN1基因DNA大片段的插入/缺失突變;通過(guò)定量PCR的方法對(duì)MLPA結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證，并且通過(guò)步移法來(lái)縮短斷裂點(diǎn)上下游的序列;Long Range PCR(長(zhǎng)片段PCR)進(jìn)行擴(kuò)增和測(cè)序，確定具體斷裂點(diǎn);提取FBN1基因48-53號(hào)外顯子缺失的患者血管組織RNA，進(jìn)行轉(zhuǎn)錄水平分析;(4)對(duì)高通量測(cè)序篩選和MLPA檢測(cè)到的變異進(jìn)行基因型表型關(guān)聯(lián)性分析。
　　結(jié)果:1.高通量測(cè)序結(jié)果:在125例患者中，96例

5、患者發(fā)現(xiàn)100個(gè)疑似的致病變異，其中55個(gè)為新突變(55.0％);97個(gè)(97.0％)疑似的致病變異位于FBN1基因，2個(gè)(2.0％)位于TGFBR1基因，1個(gè)(1.0％)位于TGFBR2基因;所有變異中包含有34個(gè)(34.0％)半胱氨酸的錯(cuò)義突變;21個(gè)(21.0％)非半胱氨酸錯(cuò)義突變;11個(gè)(11.0％)剪接位點(diǎn)突變;11個(gè)(11.0％)移碼突變和15個(gè)(15.0％)無(wú)義突變;攜帶兩個(gè)疑似致病變異的患者:發(fā)現(xiàn)3例患者攜帶兩個(gè)疑似的致

6、病變異;對(duì)家系成員測(cè)序分析，發(fā)現(xiàn)其中1例患者為復(fù)合雜合，而另2例為的兩個(gè)致病變異發(fā)生在同一等位基因;2.家系研究:在一個(gè)家系中發(fā)現(xiàn)FBN1基因附近marker與疾病表型連鎖，通過(guò)對(duì)FBN1基因重測(cè)序發(fā)現(xiàn)41號(hào)外顯子發(fā)生移碼插入突變;與FBN1不連鎖家系，經(jīng)過(guò)醫(yī)學(xué)外顯子組基因高通量測(cè)序，發(fā)現(xiàn)位于SMAD3基因突變;發(fā)現(xiàn)CKB基因?yàn)殡p胞胎家系候選致病基因。3.基因組重排檢測(cè)結(jié)果:通過(guò)MLPA檢測(cè)，共發(fā)現(xiàn)有4例患者分別攜帶有FBN1基因的6號(hào)

7、，48-53號(hào)，49-50號(hào)和1-36號(hào)外顯子的大片段缺失，通過(guò)長(zhǎng)片段PCR(Long Range PCR)進(jìn)行長(zhǎng)片段擴(kuò)增和測(cè)序，確定該4例患者分別缺失了16，551 bp，10，346bp，4，563 bp和187，067 bp;通過(guò)分析患者血管組織mRNA水平發(fā)現(xiàn)缺失的48-53號(hào)為非移碼缺失缺失，其后的mRNA在體內(nèi)保持穩(wěn)定不被降解，由此推測(cè)6號(hào)和49-50號(hào)外顯子缺失可能也為非移碼缺失。而1-36號(hào)外顯子缺失突變范圍包含F(xiàn)BN1

8、基因上游11.5kb，使缺失的等位基因不能正常轉(zhuǎn)錄翻譯。4.基因型表型相關(guān)性分析:發(fā)現(xiàn)攜帶半胱氨酸錯(cuò)義突變的患者和攜帶剪接位點(diǎn)突變的患者與攜帶截短突變的患者相比，更容易患晶狀體脫位，兩例色氨酸突變?yōu)榫彼岬幕颊呤?。心血管方面，攜帶截短(PTC)突變的患者相較于剪接位點(diǎn)突變的患者更容易患主動(dòng)脈夾層。攜帶FBN1基因p.C123G變異患者表現(xiàn)為罕見(jiàn)的頸總動(dòng)脈夾層。5.結(jié)合以往研究報(bào)道對(duì)大片段缺失的患者進(jìn)行基因型—表型分析發(fā)現(xiàn)，大片段非移碼

9、缺失突變患者表型取決于缺失位置及片段大小，但傾向于嚴(yán)重新生兒型MFS。大片段缺失(FBN1)引起單倍劑量不足導(dǎo)致的MFS，癥狀多表現(xiàn)為經(jīng)典的MFS癥狀。
　　結(jié)論:1.本研究通過(guò)PGM測(cè)序技術(shù)，檢測(cè)到中國(guó)MFS人群中103個(gè)疑似的致病突變，其中有55個(gè)為新突變，豐富了MFS的基因突變譜;2.攜帶FBN1基因剪接位點(diǎn)突變和半胱氨酸錯(cuò)義突變的患者相對(duì)于攜帶PTC的患者更傾向于患晶狀體脫位;而PTC變異導(dǎo)致的患者，更傾向于患主動(dòng)脈夾層;

10、攜帶FBN1基因PTC突變的患者與攜帶TGFBR1/2基因突變的患者表型類似，均表現(xiàn)為不易患晶狀體異位，易患主動(dòng)脈夾層。提示MFS患者眼部異常與原纖維蛋白-1結(jié)構(gòu)變化相關(guān)，主動(dòng)脈夾層與TGFβ信號(hào)通路改變相關(guān)。3.MLPA是檢測(cè)MFS大片段缺失/重復(fù)的有效手段，攜帶非移碼缺失突變的患者傾向于表現(xiàn)為新生兒MFS，單倍劑量不足引起的MFS多表現(xiàn)為經(jīng)典型;4.復(fù)合雜合變異也能夠?qū)е翸FS，對(duì)馬凡綜合征的產(chǎn)前篩查具有重要提示作用。
　　研

11、究?jī)?nèi)容二 成人支氣管擴(kuò)張致病基因篩查及病因?qū)W研究
　　支氣管擴(kuò)張（Bronchiectasis，簡(jiǎn)稱支擴(kuò)）是一種常見(jiàn)的氣道炎癥疾病，因反復(fù)氣道感染和炎癥造成支氣管和細(xì)支氣管管腔異常擴(kuò)張，關(guān)于該病尤其是非囊性纖維化支氣管擴(kuò)張(non-CF bronchiectasis，NCFB)的病因、發(fā)病機(jī)制及疾病進(jìn)展過(guò)程等的相關(guān)研究國(guó)內(nèi)仍較匱乏。支氣管擴(kuò)張是一種異質(zhì)性很強(qiáng)的疾病，目前對(duì)該病的治療手段有限，嚴(yán)重影響著患者的生活質(zhì)量。目前對(duì)支氣管擴(kuò)

12、張的病因?qū)W評(píng)估分類研究?jī)H能解釋約50％的患者。患者的病因?qū)W明確有助于患者的管理，改善患者治療方法以及鞏固長(zhǎng)期療效。
　　目的:研究中國(guó)成人支氣管擴(kuò)張患者病因組成。從遺傳學(xué)角度揭示支氣管擴(kuò)張患者的遺傳易感性，為支氣管擴(kuò)張患者病因?qū)W分類提供新的標(biāo)準(zhǔn)。
　　方法:1.研究對(duì)象:知情同意基礎(chǔ)上收集192例中國(guó)成人支氣管擴(kuò)張患者以及100例確診無(wú)肺部疾病的正常對(duì)照個(gè)體外周血;2.研究方法:(1)192例支氣管擴(kuò)張患者的病因?qū)W分類;(2

13、)高通量測(cè)序:通過(guò)Ion torrent PGM測(cè)序平臺(tái)對(duì)192例支擴(kuò)患者以及100例正常個(gè)體進(jìn)行靶基因Panel測(cè)序;測(cè)序完成后數(shù)據(jù)通過(guò)wANNOVAR網(wǎng)站注釋VCF格式的原始文件;對(duì)二代測(cè)序結(jié)果進(jìn)行常規(guī)篩選，保留可能致病的變異位點(diǎn);通過(guò)致病性軟件對(duì)變異位點(diǎn)進(jìn)行致病性判斷;對(duì)所篩選到的結(jié)果進(jìn)行Sanger測(cè)序驗(yàn)證，根據(jù)變異類型進(jìn)行分類統(tǒng)計(jì);(3)對(duì)192例患者及100例正常對(duì)照進(jìn)行CFTR基因8號(hào)內(nèi)含子區(qū)域(TG)m Tn重復(fù)序列的P

14、CR擴(kuò)增，使用ABI3730型號(hào)的DNA測(cè)序分析儀器測(cè)序后分析(TG)m Tn重復(fù)次數(shù);(4)分析CFTR基因雙等位基因突變和CFTR/ENaC基因雙重雜合變異，以及分析CFTR基因V470M多態(tài);篩選囊性纖維化(PCD)相關(guān)致病基因的純合變異，復(fù)合雜合突變;比較192例患者與100例正常個(gè)體的PCD相關(guān)致病基因的突變頻率。(4)基因型—表型分析，統(tǒng)計(jì)攜帶DNAH5，DNAH11雙等位基因突變和CFTR/ENaC雙重雜合變異的患者的表型

15、，比較各個(gè)基因突變導(dǎo)致的患者的支氣管擴(kuò)張嚴(yán)重程度綜合評(píng)分（BSI值）。(5)對(duì)發(fā)現(xiàn)致病變異的患者進(jìn)行病因?qū)W統(tǒng)計(jì)，并統(tǒng)計(jì)遺傳因素在支氣管擴(kuò)張發(fā)病中所占的比例。
　　結(jié)果:(1)本研究對(duì)中國(guó)成人支氣管擴(kuò)張患者人群進(jìn)行了病因?qū)W分類，發(fā)現(xiàn)31.8％患者為特發(fā)性，27.6％的患者為感染后發(fā)病，13.0％的患者為免疫缺陷，4.2％的患者為哮喘，3.1％的患者為胃食管反流，其他類型為8.3％。(2)通過(guò)CFTR基因和上皮鈉離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因（EN

16、aC）的基因篩查，共發(fā)現(xiàn)3例患者攜帶位于CFTR基因的復(fù)合雜合突變，其中1例患者為IVS85T(TGmT5)純合變異攜帶者;另外發(fā)現(xiàn)2例患者攜帶CFTR/ENaC基因雙重雜合突變;CFTR基因V470M多態(tài)，在純合M470/M470背景下，發(fā)現(xiàn)12例患者攜帶CFTR基因致病變異，正常對(duì)照組為1例，支擴(kuò)組顯著多于正常對(duì)照組(6.3％vs.1.0％，P=0.039);(3) PCD相關(guān)基因突變篩查:發(fā)現(xiàn)20例患者攜帶PCD相關(guān)基因雙等位基因

17、突變(10.4％，20/192)，其中14例攜帶DNAH11基因雙等位基因突變，4例攜帶DNAH5基因復(fù)合雜合突變，1例攜帶CCDC40基因復(fù)合雜合突變，1例攜帶HEATR2純合突變。并且發(fā)現(xiàn)1例攜帶位于X染色體的RPGR基因突變;在100例正常個(gè)體中發(fā)現(xiàn)有3例攜帶位于DNAH11基因的雙突變。(4)基因型—表型關(guān)聯(lián)性分析:發(fā)現(xiàn)攜帶有DNAH5基因突變的患者相比攜帶DNAH11基因突變患者，其表型要嚴(yán)重（BSI平均值:8.8 vs.4.

18、2）;攜帶CFTR/ENaC基因雙重雜合子的患者癥狀表型要比攜帶CFTR基因復(fù)合雜合的患者癥狀嚴(yán)重（CFTR/ENaC BSI=10Vs CFTR/CFTR BSI=5.2）。(5)共有26例患者發(fā)現(xiàn)攜帶可能致病的致病變異，占到患者總?cè)藬?shù)的13.54％。這些患者中16例病因?qū)W為特發(fā)性，5例為結(jié)核感染后發(fā)病，2例為反流，1例為lgG1免疫缺陷，1例為哮喘和1例麻疹感染后發(fā)病。
　　結(jié)論:本研究對(duì)中國(guó)成人支氣管擴(kuò)張患者人群進(jìn)行了病因?qū)W