非綜合征型耳聾高通量檢測(cè)技術(shù)及致病突變研究.pdf

1、耳聾是最常見(jiàn)的出生缺陷性疾病之一，約60％的耳聾與遺傳因素有關(guān)。遺傳性耳聾具有高度的遺傳異質(zhì)性和廣泛的種族差異，中國(guó)耳聾分子流行病學(xué)調(diào)查數(shù)據(jù)顯示，GJB2基因、SLC26A4基因和線粒體基因12S rRNA是中國(guó)耳聾人群主要致病基因，這為在中國(guó)開展耳聾基因診斷奠定了基礎(chǔ)。
　　為了滿足中國(guó)臨床對(duì)耳聾基因診斷的需求，本論文建立了一個(gè)從常見(jiàn)耳聾基因突變高通量檢測(cè)到罕見(jiàn)耳聾基因突變高效鑒定的耳聾基因診斷體系。本論文利用自動(dòng)移液工作站和飛

2、行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)建立了一套包括自動(dòng)化樣本制備和高通量耳聾基因檢測(cè)的中國(guó)人常見(jiàn)耳聾基因高通量檢測(cè)技術(shù)體系，并使用臨床樣本對(duì)該檢測(cè)體系的準(zhǔn)確性及有效性進(jìn)行了評(píng)價(jià);采用靶向基因捕獲和高通量測(cè)序技術(shù)建立了一套可高效鑒定非綜合征型耳聾患者的新致病突變的體系。上述兩個(gè)檢測(cè)體系組成了一個(gè)完整的非綜合征型耳聾基因檢測(cè)的解決方案，對(duì)提高中國(guó)耳聾基因診斷的水平具有較大意義。
　　本論文根據(jù)中國(guó)耳聾分子流行病學(xué)調(diào)查數(shù)據(jù)，選擇了中國(guó)人群常見(jiàn)的3個(gè)耳聾致病基

3、因（GJB2、SLC26A4、線粒體12S rRNA）共30個(gè)突變位點(diǎn)，建立了基于飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF-MS)技術(shù)的單一反應(yīng)檢測(cè)這30個(gè)突變位點(diǎn)的高通量檢測(cè)方法，利用該方法檢測(cè)了327例臨床明確基因診斷的非綜合征型耳聾樣本，30個(gè)突變均得到檢出，而且本論文檢測(cè)方法的結(jié)果與臨床基因診斷結(jié)果一致，符合率100％;進(jìn)一步使用該方法檢測(cè)了373例非綜合征型耳聾患者樣本，發(fā)現(xiàn)210例患者攜帶至少一個(gè)突變(56.30％，210/373)

4、，確診患者155例(41.55％，155/373)，其中GJB2基因致聾者63例(16.89％，30/373)，SLC26A4基因致聾者88例(23.59％，88/373)，線粒體基因12S rRNA致聾者4例(1.07％，4/373)，并使用基因檢測(cè)的金標(biāo)準(zhǔn)Sanger測(cè)序法對(duì)分型結(jié)果進(jìn)行了驗(yàn)證，兩種方法結(jié)果一致，符合率100％;也基于自動(dòng)移液工作站建立了血斑樣本DNA自動(dòng)化制備方法，應(yīng)用該方法和4種磁珠法DNA提取試劑盒提取了64個(gè)

5、新生兒血斑樣本DNA，DNA平均濃度在10.76ng/μl至21.88ng/μl之間，平均純度260/280在1.84至1.99之間，使用飛行時(shí)間質(zhì)譜方法檢測(cè)這64個(gè)樣本，發(fā)現(xiàn)了5個(gè)耳聾基因突變攜帶者。
　　選取了92例已使用本研究建立的質(zhì)譜檢測(cè)方法未能確診的非綜合征型耳聾樣本，這92例耳聾樣本包括了90個(gè)先證者樣本及2個(gè)受累同胞樣本，應(yīng)用包括200個(gè)耳聾相關(guān)基因的靶向基因捕獲測(cè)序技術(shù)檢測(cè)了這92例非綜合征耳聾樣本，對(duì)鑒定到的突變

6、進(jìn)行了生物信息學(xué)分析，并使用直接測(cè)序法對(duì)鑒定出的突變進(jìn)行了驗(yàn)證。結(jié)果顯示，有20個(gè)先證者可以確診，診斷率為22.2％，這20個(gè)確診的先證者的38個(gè)致病突變分布在15個(gè)耳聾基因上，其中23個(gè)是新致病突變。
　　本論文基于自動(dòng)移液工作站和飛行時(shí)間質(zhì)譜建立的中國(guó)人常見(jiàn)耳聾基因高通量檢測(cè)技術(shù)體系，具有高通量、高準(zhǔn)確性、低成本等特點(diǎn)，可以對(duì)耳聾患者進(jìn)行準(zhǔn)確快速診斷，為規(guī)?；@防控提供了有力的技術(shù)支撐。本論文建立的包含200個(gè)耳聾基因的靶向