遺傳性長QT綜合征HERG基因突變體表達(dá)載體的構(gòu)建及功能檢測.pdf

1、第一部分遺傳性長QT綜合征HERG基因E505D突變體卵母細(xì)胞異源表達(dá)載體的構(gòu)建及其功能檢測 目的:構(gòu)建遺傳性長QT綜合征HERG基因E505D突變體的卵母細(xì)胞異源表達(dá)載體，利用非洲爪蟾卵母細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行電生理學(xué)研究，探討一遺傳性長QT綜合征家系患者攜帶的E505DHERG基因突變引起LQTS的機(jī)制。 方法:利用快速PCR定點(diǎn)突變技術(shù)，設(shè)計一對引物(包含預(yù)定的突變E505D)，通過PCR，擴(kuò)增出含突變位點(diǎn)的質(zhì)粒，然后轉(zhuǎn)

2、化到超級感受態(tài)細(xì)胞中，用堿裂解法抽提質(zhì)粒，進(jìn)行測序鑒定，得到HERG基因E505D突變體的卵母細(xì)胞異源表達(dá)載體；將野生型和突變型的HERG基因的卵母細(xì)胞異源表達(dá)載體線性化，然后在體外轉(zhuǎn)錄成cRNA，通過顯微注射注入爪蟾卵母細(xì)胞，然后利用雙電極電壓鉗技術(shù)記錄膜電流。 結(jié)果:在卵母細(xì)胞異源表達(dá)載體pGH19-HERG基礎(chǔ)上獲得了E505D突變體的卵母細(xì)胞異源表達(dá)載體。E505DHERG不能檢測到電流的表達(dá)。突變型E505DHERG和

3、野生型HERG共表達(dá)檢測到的峰電流的幅度比野生型HERG表達(dá)檢測到的峰電流的幅度小，二者差異具有顯著性(p＜0.05)。突變型E505DHERG和野生型HERG共表達(dá)檢測到的尾電流的幅度比野生型HERG表達(dá)檢測到的尾電流的幅度小，二者差異具有顯著性(p＜0.05)。突變型E505DHERG和野生型HERG共表達(dá)檢測到的電流的G-V曲線與野生型HERG表達(dá)檢測到的電流相比發(fā)生右移，二者V1/2有顯著性差異(p＜0.05)。突變型E505D

4、HERG和野生型HERG共表達(dá)組內(nèi)向整流程度顯著低于野生型HERG組(p＜0.05)。突變型E505DHERG和野生型HERG共表達(dá)組穩(wěn)態(tài)激活顯著低于野生型HERG組(p＜0.05)。突變型E505DHERG和野生型HERG共表達(dá)組內(nèi)向整流斜率顯著低于野生型HERG組(p＜0.05)。 降低電流幅度和減少通道開放，使Ikr電流減弱，動作電位時程延長，導(dǎo)致LQTS。 第二部分遺傳性長QT綜合征HERG基因真核表達(dá)

5、載體的構(gòu)建及其在HEK293細(xì)胞中的表達(dá) 目的:構(gòu)建HERG基因的真核表達(dá)載體，并在人胚胎腎細(xì)胞(HEK293)中進(jìn)行表達(dá)。 方法:先將pGH19-HERG通過限制性酶切得到HERGcDNA，將后者克隆至pEGFP-C1中，構(gòu)建表達(dá)載體pEGFP-HERG；然后將pEGFP-HERG和pIRES2-EGFP分別用BamHⅠ和XbaⅠ進(jìn)行雙酶切，把HERGcDNA定向克隆到pIRES2-EGFP中，即構(gòu)建了HERG基因的真

6、核表達(dá)載體pIRES2-EGFP-HERG。然后利用電穿孔法將pIRES2-EGFP-HERG轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞。 結(jié)果:在卵母細(xì)胞異源表達(dá)載體pGH19-HERG基礎(chǔ)上，獲得了真核表達(dá)載體pIRES2-EGFP-HERG，并在HEK293細(xì)胞中成功進(jìn)行了表達(dá)。 結(jié)論:我們在HERG基因卵母細(xì)胞異源表達(dá)載體的基礎(chǔ)上，首先構(gòu)建了HERG基因的真核表達(dá)載體pIRES2-EGFP-HERG，利用電穿孔法將其轉(zhuǎn)染至HEK293

7、細(xì)胞中并成功地進(jìn)行了表達(dá)，為下一步進(jìn)行膜片鉗的研究奠定基礎(chǔ)。 第三部分遺傳性長QT綜合征HERG基因E505D突變體真核表達(dá)載體的構(gòu)建及其在HEK293細(xì)胞中的表達(dá) 目的:構(gòu)建遺傳性長QT綜合征HERG基因E505D突變體的真核表達(dá)載體，并在HEK293細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)。 方法:在HERG基因真核表達(dá)載體pIRES2-EGFP-HERG和包含E505D突變點(diǎn)的卵母細(xì)胞異源表達(dá)載體pGH19-HERG(E5

8、05D)質(zhì)粒基礎(chǔ)上，利用基因重組技術(shù)，將含有突變點(diǎn)的HERGcDNA基因片段克隆到pIRES2-EGFP-HERG中，并進(jìn)行測序鑒定；構(gòu)建了HERG基因E505D突變體的真核表達(dá)載體pIRES2-EGFP-HERG(E505D)，利用電穿孔法將其轉(zhuǎn)染至HEK293細(xì)胞，48h后將細(xì)胞置熒光顯微鏡下觀察拍照。 結(jié)果:在野生型HERG基因真核表達(dá)載體pIRES2-EGFP-HERG基礎(chǔ)上獲得了E505D突變體的真核表達(dá)載體pIRES