先天性長(zhǎng)QT綜合征的基因突變檢測(cè)及常見(jiàn)基因型與表現(xiàn)型的相關(guān)性研究.pdf

1、研究背景
　　 先天性長(zhǎng)QT綜合征(longQTsyndrome，LQTS)屬于遺傳性心律失常，是由于編碼心肌細(xì)胞離子通道的基因異常所導(dǎo)致，也被稱為“離子通道病”。LQTS患者具有QT間期延長(zhǎng)和T波形態(tài)異常的心電圖特征，臨床表現(xiàn)為反復(fù)發(fā)作的暈厥和室性心律失常，尤其是尖端扭轉(zhuǎn)性室性心動(dòng)過(guò)速(Torsadedepointes，TdP)。據(jù)統(tǒng)計(jì)，未經(jīng)治療的LQTS患者的10年死亡率高達(dá)50％，且約1/2500的患者終身伴隨猝死風(fēng)險(xiǎn)。美

2、國(guó)近年數(shù)據(jù)顯示，LQTS在人群中的發(fā)病率約1:2000～1:5000，尤其多見(jiàn)于兒童和青少年。據(jù)此推算，我國(guó)LQTS患者接近30萬(wàn)。由于LQTS具有發(fā)病突然、猝死率高、青少年多發(fā)的特點(diǎn)，目前已成為遺傳性心律失常的研究前沿和熱點(diǎn)。
　　 1991年，Keating等首次將LQTS的致病基因定位于人類11號(hào)染色體，迄今已發(fā)現(xiàn)至少13個(gè)基因與LQTS相關(guān)。根據(jù)不同基因把LQTS劃分為13個(gè)亞型:KCNQ1(LQT1)、KCNH2(LQ

3、T2)、SCN5A(LQT3)、ANK2(LQT4)、KCNE1(LQT5)、KCNE2(LQT6)、KCNJ2(LQT7)、CACNA1C(LQT8)、CAV3(LQT9)、SCN4B(LQT10)、AKAP9(LQT11)、SCNA1(LQT12)和KCNJ5(LQT13)。這些致病基因通過(guò)錯(cuò)義突變、缺失/插入突變、移碼突變和剪接突變等多種方式造成心肌離子通道功能異常。全世界已發(fā)現(xiàn)LQTS致病基因上的900多個(gè)突變位點(diǎn)。然而研究發(fā)現(xiàn)

4、，不同種族的突變位點(diǎn)存在差異，例如LQT1～LQT3基因型的非同義突變?cè)诎追N人中約4％，而其他人種約6～8％。也就是說(shuō)，LQTS患者的致病基因基本相同，而突變位點(diǎn)不盡相同。因此，基因篩查尤為必要。隨著分子遺傳學(xué)的發(fā)展，歐美已逐漸將基因檢測(cè)作為明確LQTS診斷的一種臨床手段。2011年，美國(guó)心律學(xué)會(huì)和歐洲心律學(xué)會(huì)聯(lián)合發(fā)表了《心臟離子通道病與心肌病基因檢測(cè)的專家共識(shí)》，該共識(shí)對(duì)LQTS最常見(jiàn)的3種致病基因(KCNQ1、KCNH2和SCN5A

5、)篩查做了重點(diǎn)推薦，其中，臨床診斷明確以及高度可疑的LQTS患者均被建議進(jìn)行上述基因檢測(cè)。近幾年，我國(guó)研究者共發(fā)現(xiàn)約50個(gè)與國(guó)人LQTS相關(guān)的突變位點(diǎn)。由于基因檢測(cè)價(jià)格昂貴，目前我國(guó)針對(duì)LQTS的基因檢測(cè)多用于科研，臨床遠(yuǎn)未普及。
　　 LQTS的臨床診斷主要基于患者靜息心電圖的QTc數(shù)值、暈厥病史及心源性猝死家族史。然而，約10～40％的患者和致病基因攜帶者的靜息QTc值正常。因此，對(duì)臨床高度可疑的患者篩查特定基因十分重要。有

6、報(bào)道稱，有明顯LQTS臨床表現(xiàn)的患者，其致病突變的檢出率約75％。Tester等研究發(fā)現(xiàn)，LQTS的特定基因型和表現(xiàn)型密切相關(guān)，尤其是LQT1～LQT3型患者，其心電圖T波形態(tài)和發(fā)病誘因都具有顯著特征。如LQT1型患者的典型T波表現(xiàn)為基底部寬大且上升支和下降支光滑;LQT2的T波特征是低平或雙峰狀;LQT3則以延遲出現(xiàn)的高尖雙相T波為特有表現(xiàn)。在發(fā)病誘因方面，LQT1型患者多在運(yùn)動(dòng)、游泳等交感神經(jīng)興奮時(shí)發(fā)生暈厥或猝死，LQT2和LQT3

7、型患者則于休息或睡眠時(shí)多發(fā)心血管事件。值得關(guān)注的是，聽(tīng)覺(jué)刺激是LQT2的特定觸發(fā)因素。特異的臨床表現(xiàn)不僅有利于進(jìn)行靶基因檢測(cè)，從而明確基因型，而且有助于制定個(gè)體化治療方案。由于LQTS各基因型的發(fā)病機(jī)制不同，患者對(duì)藥物的敏感程度并不相同。作為首選用藥，β受體阻滯劑能顯著減少LQT1患者的暈厥次數(shù);LQT2患者服藥后的暈厥復(fù)發(fā)率仍較高;而對(duì)于鈉通道基因突變導(dǎo)致的LQT3型，β受體阻滯劑往往效果較差，應(yīng)首選ICD治療。由此可見(jiàn)，基于臨床特征

8、的基因篩查能提高診斷率以及更有效地指導(dǎo)治療。LQTS包括兩種遺傳方式，分別是常染色體顯性遺傳的Romano-Ward綜合征(RWS)和常染色體隱性遺傳的JervellandLange-Nilsen綜合征(JLNS)。RWS最常見(jiàn)的致病基因?yàn)镵CNQ1和KCNH2，KCNQ1和KCNE1是JLNS的致病基因。根據(jù)指南推薦，首先篩查出LQTS先證者的突變基因，再對(duì)家系成員進(jìn)行相同位點(diǎn)的基因檢測(cè)。不攜帶先證者的致病突變是家系成員排除LQTS的

9、唯一方法。
　　 本研究中，我們收集了3例LQTS先證者及其家系成員的臨床資料并進(jìn)行分析，力圖明確LQTS的常見(jiàn)基因型和表現(xiàn)型的關(guān)聯(lián)性。同時(shí)，在根據(jù)T波形態(tài)預(yù)測(cè)基因型后，我們篩查了各先證者的相關(guān)基因;待發(fā)現(xiàn)突變，再檢測(cè)該家系成員的相同位點(diǎn)，以期發(fā)現(xiàn)國(guó)人LQTS相關(guān)的基因突變。
　　 研究目的
　　 1、本研究收集了3例LQTS先證者及其家系成員共22人的臨床資料，通過(guò)分析研究對(duì)象的病史、發(fā)病誘因、靜息心電圖QTc

10、值及T波特異形態(tài)，力圖明確LQT1型和LQT2型患者基因型和表現(xiàn)型的關(guān)系。
　　 2、本研究篩查了1例JLNS先證者的KCNQ1和KCNE1基因;篩查了2例RWS先證者的KCNQ1和KCNH2基因，待檢測(cè)出突變位點(diǎn)后，再對(duì)其家系成員進(jìn)行相同位點(diǎn)的基因檢測(cè)，以期發(fā)現(xiàn)LQTS的基因突變位點(diǎn)。
　　 研究對(duì)象
　　 依據(jù)Schwartz等提出的先天性長(zhǎng)QT綜合征診斷評(píng)分標(biāo)準(zhǔn):≥4分診斷為L(zhǎng)QTS患者，且為入選標(biāo)準(zhǔn)。對(duì)2

11、007年3月至2011年3月在南方醫(yī)科大學(xué)附屬南方醫(yī)院心內(nèi)科的住院患者進(jìn)行篩查，共確診3例LQTS先證者，男1例，女2例，均為漢族，來(lái)自廣東省。結(jié)合2011年HRS/EHRA發(fā)表的共識(shí)中關(guān)于LQTS基因篩查的推薦，對(duì)先證者及家系成員（包括先證者的同代、子女及父母）共22人進(jìn)行了臨床資料收集。100名來(lái)自體檢中心的健康成人參與了本研究。上述研究對(duì)象均已知情同意。
　　 所有研究對(duì)象均已排除血管迷走性暈厥、直立性低血壓、致心律失常性

12、右室心肌病、兒茶酚胺型室性心動(dòng)過(guò)速以及獲得性長(zhǎng)QT綜合征的各種病因，包括:1、藥物引起的QT間期延長(zhǎng):抗心律失常藥物、抗生素、抗精神病藥物、化療藥物等;2、電解質(zhì)紊亂及全身系統(tǒng)疾病:低鉀血癥、低鈣血癥，糖尿病、結(jié)締組織病，腎功能衰竭、嗜鉻細(xì)胞瘤等;3、器質(zhì)性心臟病:冠心病、心肌肥厚、心力衰竭、心肌病、二尖瓣脫垂等。
　　 研究方法
　　 1、收集并分析先證者及家系成員的臨床資料，記錄安靜狀態(tài)下12導(dǎo)聯(lián)同步心電圖。采用Sc

13、hwartz評(píng)分系統(tǒng)診斷LQTS，并根據(jù)Zhang等提出的特異T波形態(tài)預(yù)測(cè)患者基因型。必要時(shí)行24h動(dòng)態(tài)心電圖或運(yùn)動(dòng)試驗(yàn)明確診斷。臨床資料包括患者是否出現(xiàn)暈厥和首次發(fā)作時(shí)間、暈厥的誘發(fā)因素（運(yùn)動(dòng)、情緒激動(dòng)或安靜、睡眠等）、是否有心源性猝死家族史及既往診治情況等。抽取所有研究對(duì)象外周血5ml，EDTA法抗凝，置于-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?br>　　 2、采用常規(guī)苯酚-氯仿法提取外周血白細(xì)胞基因組DNA，瓊脂糖凝膠電泳及紫外分光光度計(jì)檢測(cè)提

14、取產(chǎn)物并置于-20℃保存。參照Splawski和Syrris等的相關(guān)研究設(shè)計(jì)KCNQ1基因的17對(duì)引物、KCNE1基因的3對(duì)引物和KCNH2基因的19對(duì)引物，交由上海英濰捷基生物公司合成。采用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增三個(gè)基因的全部外顯子。PCR反應(yīng)體系如下:采用Platinum(○R)Taq反應(yīng)體系共25uL，除了1uL模板DNA，其余24uL的Supermix組成為:10×PCR緩沖液2.5uL，2.5mMdNTP混合液2uL，50

15、mMMgCl20.75uL，5uM上游及下游引物各1uL，Platinum(○R)TaqDNA聚合酶0.2uL，其余加入滅菌蒸餾水補(bǔ)足體積。上述反應(yīng)體系的擴(kuò)增條件為:94℃預(yù)變性5min，94℃變性30s，58℃退火45s及72℃延伸90s，經(jīng)過(guò)35個(gè)循環(huán)后，再以72℃5min延伸，終末以4℃保存。PCR完成后采用1.5％瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳鑒定，對(duì)于電泳結(jié)果不滿意的，重新優(yōu)化反應(yīng)體系和反應(yīng)條件，直至最佳效果。最后由上海英濰捷基生物公司采

16、用3730XL型DNA測(cè)序儀對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物直接測(cè)序。測(cè)序結(jié)果應(yīng)用Chromas軟件進(jìn)行BLAST同源比較，如有堿基改變，則在NCBI的SNP數(shù)據(jù)庫(kù)中查找，確定是否為已公布的變異位點(diǎn)，明確是否存在氨基酸序列改變。擴(kuò)增家系成員該變異位點(diǎn)的相應(yīng)外顯子，并進(jìn)行基因檢測(cè)分析。同時(shí)篩查100名正常對(duì)照成員。
　　 結(jié)果
　　 1、Schwartz評(píng)分≥4分者3例，診斷為L(zhǎng)QTS。其中男1例，女2例，年齡23～46歲，首次發(fā)病年齡15～4

17、6歲，QTc值486～582ms。評(píng)分為2～4分者2例，為臨床可疑病例。余家系成員評(píng)分均≤1。家系成員B2，評(píng)分為1，經(jīng)基因檢測(cè)診斷為致病基因攜帶者。研究對(duì)象中5例有暈厥史，其中4例在情緒刺激、運(yùn)動(dòng)或勞累時(shí)誘發(fā)，1例于夜間休息、睡眠中發(fā)作。1例有猝死家族史，隨訪過(guò)程中研究對(duì)象均未發(fā)生猝死。T波形態(tài)預(yù)測(cè)基因型:LQT1型2例，LQT2型2例，未發(fā)現(xiàn)其它基因型。1例家系成員的的心電圖特征不明顯，無(wú)法預(yù)測(cè)。家系A(chǔ)先證者及其子均伴先天性耳聾，屬

18、于JLNS;B和C為RWS家系。先證者A1和C1服用β受體阻斷劑有效，B1效果差。
　　 2、DNA測(cè)序結(jié)果顯示先證者B1及哥哥B2存在KCNQ1基因突變，該突變位點(diǎn)在第6號(hào)外顯子上，表現(xiàn)為第830個(gè)核苷酸C（胞嘧啶）突變?yōu)門（胸腺嘧啶），導(dǎo)致編碼Iks的α亞單位第277位密碼子由絲氨酸(TCG)突變?yōu)榱涟彼?TTG)。此錯(cuò)義突變S277L位于KCNQ1的跨膜片段上。該家系其余成員及100名正常對(duì)照者均未發(fā)現(xiàn)該突變，NCBI基因