一個Axenfeld-Rieger綜合征患者致病基因突變檢測與功能研究.pdf

1、Axenfeld-Rieger綜合征(ARS)是一種罕見的常染色體顯性遺傳病,發(fā)病率為1:200000。其主要臨床癥狀為眼前段、顱面部、臍和牙齒等發(fā)育異常,約50％的病人會發(fā)展為青光眼,部分患者還伴隨垂體功能異常、中耳耳聾、心臟缺陷、尿道下裂、生長遲緩和智力低下等癥狀。目前,已發(fā)現(xiàn)兩個ARS的致病基因PITX2和FOXC1,分別位于染色體4q25和6p25區(qū)域。此外還有一個致病位點位于染色體13q14區(qū)域,尚未發(fā)現(xiàn)致病基因。
　　

2、我們收集并鑒定了一名ARS患者,該患者眼睛發(fā)育異常、雙目有翳,視力低下,畏光;牙齒缺失,所見為義齒;指(趾)甲大小正常,但未見繼續(xù)生長;肚臍向外突出。首先對 PITX2基因的所有外顯子及外顯子和內(nèi)含子交界處進行直接測序,將測到的序列與正常的PITX2基因序列比對,發(fā)現(xiàn)患者PITX2基因4號內(nèi)含子的-11位有一個A到 G的堿基改變,即 IVS4-11A>G。對患者的母親、小姨和同母異父弟弟的PITX2基因進行測序,結(jié)果顯示他們并不攜帶這一

3、改變?；颊吒副硇鸵舱?我們推測患者攜帶的IVS4-11A>G可能是一個新發(fā)改變。生物信息學預(yù)測該改變可能產(chǎn)生一個新的剪切受體位點。該基因在外周血中表達量很低,為了驗證 IVS4-11A>G改變是否影響剪切,我們從患者和正常人的基因組中分別構(gòu)建了包含堿基改變位點的微小基因載體,分別轉(zhuǎn)染Hela細胞,并進行RT-PCR和測序分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn)該堿基改變導(dǎo)致剪接方式的改變,即RT-PCR產(chǎn)物引入4號內(nèi)含子3’端的10個堿基,導(dǎo)致PITX2在13

4、1位氨基酸處發(fā)生移碼,產(chǎn)生一個預(yù)測包含246個氨基酸的新蛋白(突變的PITX2)。預(yù)測該突變的PITX2缺失部分同源結(jié)構(gòu)域(homeodomain, HD)和全部的OAR(otp aristaless and rax)結(jié)構(gòu)域,打亂了PITX2的核定位信號(nuclear localization signal, NLS),影響PITX2的細胞核定位。為了檢驗該突變體的功能,我們構(gòu)建野生型和突變型PITX2-pEGFP-C1載體,轉(zhuǎn)染He

5、la細胞并用共聚焦顯微鏡觀察,發(fā)現(xiàn)突變蛋白的亞細胞定位確實發(fā)生了改變。與正常蛋白全部定位于細胞核內(nèi)不同,突變蛋白主要分布在細胞質(zhì)中,且定位于細胞質(zhì)中的蛋白分布不均勻,有明顯的點狀聚集。并且突變蛋白絕大部分與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)共定位,僅有少部分與高爾基體共定位。
　　PITX2在脊椎動物的心臟、肺、大腦、牙齒和垂體中廣泛表達,它參與Nodal-Shh通路和Wnt-Frizzled-β-catenin通路,在胚胎發(fā)育早期起重要的調(diào)控作用。參與調(diào)控

6、眼前段發(fā)育的DKK2基因和參與調(diào)控牙齒發(fā)育的DLX2基因等都是PITX2的下游靶基因。IVS4-11A>G突變導(dǎo)致PITX2缺失部分HD結(jié)構(gòu)域和全部的OAR結(jié)構(gòu)域,可能喪失特異性結(jié)合DNA以及轉(zhuǎn)錄激活的能力,并且導(dǎo)致部分突變蛋白不能進入細胞核內(nèi),這都將使PITX2無法發(fā)揮轉(zhuǎn)錄激活下游靶基因的能力,不能正常調(diào)控眼前段和牙齒的發(fā)育,從而導(dǎo)致ARS的發(fā)生?？傊?本研究通過分子遺傳學和分子生物學等手段,確定了一個ARS患者的致病基因和突變,并對