人膠質瘤TERT基因啟動子突變分析和致病機制研究以及一個Alport綜合征家系的基因突變分析.pdf

1、本文主要從以下幾部分論述：
　　論文一 人膠質瘤TERT基因啟動子突變分析及致病機制研究
　　目的：
　　本研究對101例膠質瘤標本，49例其他顱內腫瘤標本和5種膠質瘤細胞系進行TERT基因啟動子區(qū)突變分析，并檢測野生及突變型腫瘤組織中TERT的mRNA表達;結合患者的臨床、病理資料及隨訪信息等進行相關的統(tǒng)計分析并繪制生存曲線。為進一步證實TERT啟動子突變作用的分子機制，我們利用雙熒光素酶報告基因實驗，證明突變型TE

2、RT啟動子活性顯著高于野生型。最后我們模擬腫瘤微環(huán)境改變，證實在低氧環(huán)境/化療藥物作用下，突變型啟動子仍能夠維持較高轉錄活性。
　　材料方法：
　　一、膠質瘤中TERT基因啟動子區(qū)突變篩查
　　提取101例膠質瘤組織及5種膠質瘤細胞系的基因組DNA。此外還提取了49例其他顱內腫瘤，包括22例腦膜瘤，17例垂體瘤，6例顱內轉移瘤和4例海綿狀血管瘤，以及2例正常腦組織的基因組DNA。PCR擴增TERT核心啟動子區(qū)，進行Sa

3、nger測序分析。
　　二、膠質瘤中TERT mRNA表達水平檢測
　　提取6例TERT啟動子突變型，2例TERT啟動子野生型膠質瘤組織及2例正常腦組織中總RNA，反轉錄后進行實時熒光定量PCR，比較野生型及突變型膠質瘤組織中TERT的mRNA表達情況。
　　三、結合膠質瘤患者臨床及病理資料，根據TERT啟動子突變狀態(tài)進行統(tǒng)計分析
　　針對患者的性別、年齡、腫瘤位置、腫瘤累及范圍、腫瘤大小、術前KPS評分、手術切

4、除方式及病理級別進行分類，結合TERT啟動子突變狀態(tài)，采用t檢驗分析不同指標的平均值，x2檢驗用于比較不同變量的構成比;利用Cox風險回歸模型對不同亞型膠質瘤患者進行生存分析。
　　四、雙熒光素酶報告基因實驗檢測TERT啟動子區(qū)突變對其轉錄活性的影響
　　構建包含TERT基因核心啟動子的螢火蟲熒光素酶報告基因質粒，轉染培養(yǎng)的U87細胞，24小時后進行熒光素酶報告基因活性檢測。
　　五、腫瘤微環(huán)境改變對TETR突變型啟動

5、子轉錄活性的影響
　　應用體外雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)，對體外培養(yǎng)的U87細胞，進行CoCl2刺激模擬腫瘤細胞缺氧或直接置于1％O2的低氧培養(yǎng)箱培養(yǎng)，以及加入化療藥物替莫唑胺作用，24小時后進行熒光素酶報告基因活性檢測。
　　結果：
　　一、膠質瘤組織及細胞系中均存在TERT啟動子的高頻突變
　　Sanger測序分析結果表明膠質瘤中存在TERT啟動子的高頻突變，在101例膠質瘤組織中，發(fā)現(xiàn)45例(44.6％)存在T

6、ERT啟動子突變，-124C＞T突變33例，-146C＞T突變12例。在5種膠質瘤細胞系中，均存在TERT基因啟動區(qū)不同位點的突變。在腦膜瘤，垂體腺瘤，海綿狀血管瘤，顱內轉移瘤和正常腦組織，以及對應的患者的外周血基因組DNA中均未發(fā)現(xiàn)TERT啟動子突變。
　　二、膠質瘤中TERT啟動子突變顯著增強其mRNA表達水平
　　實時熒光定量PCR結果顯示，與正常腦組織相比，5例TERT突變型腫瘤組織中TERT表達均增高，具有統(tǒng)計學意

7、義(P＜0.05);在TERT野生型腫瘤組織中，未觀察到TERT mRNA表達的顯著增高。
　　三、膠質瘤中TERT啟動子突變與患者年齡及病理級別顯著相關
　　x2檢驗結果表明TERT啟動子突變狀態(tài)與患者年齡和病理級別顯著相關(P=0.004)，高年齡組TERT啟動子突變率高于低年齡組，高級別膠質瘤TERT突變頻率高于低級別膠質瘤(P=0.039)。
　　四、高級別膠質瘤及星形細胞瘤中TERT啟動子突變型患者總體生存率

8、顯著低于野生型
　　應用Cox風險回歸模型，對不同級別膠質瘤進行回歸分析，結果提示在高級別膠質瘤及星形細胞瘤中，與TERT啟動子野生型的患者相比，攜帶突變型TERT啟動子患者總體生存率低，提示預后不良（P＜0.05）。
　　五、TERT基因啟動子突變增強自身轉錄活性
　　雙熒光素酶報告基因實驗證明，TERT基因啟動子區(qū)-124和-146位點突變后，TERT自身轉錄活性均顯著升高，且該過程依賴于Ets/TCF轉錄因子介導

9、的轉錄激活。TERT啟動子區(qū)-245位SNP rs2853669對突變所致的轉錄激活具有恢復作用。
　　六、腫瘤微環(huán)境改變條件下TERT突變型啟動子仍能夠維持自身的高轉錄活性
　　在低氧及化療藥物TMZ作用下，突變型TERT啟動子仍然維持顯著高于野生型的轉錄活性。
　　結論：
　　1、膠質瘤中存在TERT啟動子區(qū)的高頻率突變。
　　2、TERT啟動子突變型膠質瘤組織中TERT mRNA表達水平顯著升高。

10、r>　　3、TERT啟動子-124及-146位點突變導致Ets/TCF依賴的自身轉錄活性增強。
　　4、膠質瘤中TERT啟動子突變與患者年齡及病理級別顯著相關。
　　5、在高級別膠質瘤及星形細胞瘤中，TERT啟動子突變型患者總體生存率下降，提示預后不良。
　　6、在腫瘤微環(huán)境改變時，即缺氧及化療藥物TMZ作用下，突變型TERT啟動子仍能夠保持高轉錄活性。
　　論文二 一個Alport綜合征家系的基因突變分析

11、>　　目的：
　　本研究目的在于利用新一代測序技術鑒定一個中國X連鎖AS家系中的基因突變，輔助臨床診斷，提供準確的遺傳咨詢，并為產前診斷提供依據。
　　方法：
　　一、家系資料
　　對家系中可能追溯到的家庭成員進行詳細調查，記錄患者臨床癥狀及檢查結果并繪制系譜圖，抽取患者及家系成員外周靜脈血。
　　二、基因組DNA提取及定量
　　采用QIAgen外周血中量提取試劑盒提取基因組DNA，并使用高精度熒光計

12、進行基因組DNA定量，用于下一步的高通量測序。
　　三、新一代高通量測序
　　1.利用Ion torrent的PGM測序平臺進行新一代半導體測序。首先進行文庫制備，然后連接Adapter和Barcode，DNA片段純化，洗脫以及文庫擴增，文庫質量評估，模板制備與富集，芯片上樣，上機測序。
　　2.所得數(shù)據經Ion Torrent Suite3.2軟件初步分析和dbSNP數(shù)據庫過濾得到檢出的變異。
　　3.通過In

13、tegrative Genomics Viewer(IGV)軟件可視化查看靶向區(qū)域內每個堿基的測序情況，排除假陽性結果和panel覆蓋不全區(qū)域的假陰性結果。
　　四、Sanger測序驗證及RFLP分析
　　通過數(shù)據分析及IGV軟件檢查，排除假陽性結果，對所獲得的變異位點及panel覆蓋不好的區(qū)域，設計PCR引物進行Sanger測序驗證。針對新突變位點，利用RFLP方法驗證其在正常人群的頻率。
　　五、cDNA分析

14、>　　提取家系成員新鮮外周血總RNA，反轉錄為eDNA。設計涵蓋突變位點的cDNA引物，PCR擴增后進行電泳檢測，并進行Sanger測序及克隆測序分析。
　　結果：
　　一、患者臨床表現(xiàn)及家系分析
　　先證者男性，首次發(fā)病年齡7歲，肉眼血尿，進行性蛋白尿和高血壓，25歲時發(fā)展為終末期腎病，接受腎移植治療。家系中主要為男性發(fā)病，女性雜合子個體有輕微鏡下血尿或無任何癥狀，符合X連鎖顯性遺傳方式。
　　二、新一代高通量

15、測序結果
　　高通量測序共產生數(shù)據量855.8M，平均測序深度＞100×，覆蓋度＞98％，經過數(shù)據分析和dbSNP137數(shù)據庫過濾，未發(fā)現(xiàn)明確的致病突變。利用IGV軟件瀏覽，主要關注COL4A3，COL4A4和COL4A5基因，COL4A5基因中第10號外顯子未被覆蓋，外顯子4，17，20，21，37和45覆蓋不完全。
　　三、Sanger測序驗證及RFLP結果
　　對以上未被遺傳病panel覆蓋或覆蓋不全的7個片段進

16、行PCR擴增和Sanger測序分析，結果顯示在先證者的內含子9外顯子10邊界存在c.547-3C＞A的剪接突變，該突變在家系內共分離。選取140名無關對照個體，進行RFLP分析，未發(fā)現(xiàn)正常個體中存在該突變位點。檢索人類基因突變數(shù)據庫和千人基因組數(shù)據庫，均未發(fā)現(xiàn)關于該突變位點的報道。
　　四、cDNA分析結果
　　RT-PCR結果顯示，與正常個體相比，先證者產生一個較短的異常轉錄本，先證者母親則包含了野生和異常的兩個轉錄本。P