Alport綜合征一家系分析及其COL4A5基因突變的研究.pdf

1、Alport綜合征 (Alport syndrome，AS) 是一種以進(jìn)行性。腎功能減退和腎小球基底膜結(jié)構(gòu)異常伴神經(jīng)性耳聾，眼病為臨床特征的遺傳性腎病?；蛟\斷是目前最為可靠的診斷AS患者的方法，也是確定遺傳型的方法和證據(jù)、確定攜帶者的診斷手段。目前，國(guó)內(nèi)外學(xué)者已報(bào)道380多種COL4A5基因突變，突變類型多種多樣，未發(fā)現(xiàn)有“熱點(diǎn)突變”，檢測(cè)COL4A5基因突變的方法也各不相同，但檢測(cè)的靈敏度都較低。研究方便、高效、快捷的基因診斷方法，

2、已成為現(xiàn)今國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)。本研究通過(guò)對(duì)一AS家系進(jìn)行臨床分析并應(yīng)用多重PCR－單鏈構(gòu)象多態(tài)性(single strand conformation polymorphism，SSCP)的方法檢測(cè)COL4A5基因突變，分析我國(guó)AS患者臨床特點(diǎn)，試圖建立一種簡(jiǎn)捷、高效的AS基因診斷方法。 目的: 調(diào)查Alport綜合征的遺傳方式及臨床特點(diǎn)，研究我國(guó)X連鎖顯性遺傳AS編碼Ⅳ型膠原α<,5>鏈的COL45基因突變及臨床特點(diǎn)，建

3、立一種簡(jiǎn)捷、高效的AS基因診斷方法。 方法: 對(duì)本家系(30人)進(jìn)行家系調(diào)查及現(xiàn)存24例成員進(jìn)行體格檢查、實(shí)驗(yàn)室檢查、病理及超微結(jié)構(gòu)檢查。提取本家系15例現(xiàn)存家系成員及2例無(wú)腎臟病表現(xiàn)及家族史的正常對(duì)照基因組DNA。根據(jù)COL4A5基因中與外顯子相鄰的內(nèi)含子序列，設(shè)計(jì)52對(duì)引物擴(kuò)增COL4A5基因53個(gè)外顯子及啟動(dòng)子區(qū)域，將52對(duì)引物分成9組多重PCR組合，其中7組包含6對(duì)不同的引物，2組包含5對(duì)不同引物，擴(kuò)增COL4A

4、5基因全部外顯子區(qū)域。以非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳鑒定產(chǎn)物，再作SSCP分析，如有遷移率異常組，對(duì)該組所有外顯子再單獨(dú)進(jìn)行擴(kuò)增及SSCP分析，如仍檢測(cè)到遷移率異常的單鏈條帶，則對(duì)該P(yáng)CR產(chǎn)物直接測(cè)序。測(cè)序結(jié)果與Genbank中的COL4A5基因正常序列比對(duì)，尋找突變位點(diǎn)。 結(jié)果: 本家系中15例符合AS診斷標(biāo)準(zhǔn)，男性6例，女性9例，其中5例因終末期腎衰竭已死亡?，F(xiàn)存10例AS患者均有血尿，其中伴有蛋白尿者有7例；神經(jīng)性耳聾

5、6例；眼病7例。12例有球蛋白升高，6例有脂蛋白升高，5例有總膽固醇升高，5例有甘油三脂升高。以全血基因組DNA為模板，成功擴(kuò)增COL4A5基因所有外顯子，將52個(gè)外顯子分成9組進(jìn)行多重PCR，有7組可成功擴(kuò)增出全部外顯子，而第7組的exon24及第9組的exon5+6未擴(kuò)增出，經(jīng)單獨(dú)擴(kuò)增可獲得滿意的PCR產(chǎn)物。將多重PCR產(chǎn)物及單個(gè)PCR產(chǎn)物進(jìn)行SSCP分析，經(jīng)AgNO<,3>染色后均可見(jiàn)清晰的單鏈條帶，發(fā)現(xiàn)本家系成員Ⅱ<,4>、Ⅲ<

6、,4>、Ⅲ<,12>第1組存在遷移率異常的條帶，以Ⅱ<,4>、Ⅲ<,4>、Ⅲ<,12的DNA為模板重新單獨(dú)擴(kuò)增第1組所有外顯子后再進(jìn)行SSCP分析，未發(fā)現(xiàn)有遷移率異常的單鏈條帶。單獨(dú)擴(kuò)增所有標(biāo)本的exon24及exon5+6后進(jìn)行SSCP分析，未發(fā)現(xiàn)有單鏈DNA遷移率異常者。 結(jié)論: 1．本家系遺傳方式為X連鎖顯性遺傳，血尿和蛋白尿發(fā)生率較高；高球蛋白血癥、高血脂發(fā)生率較高，其意義尚待探討。 2．基本排除本家系C