類脂蛋白沉積癥一家系的ECM1基因突變研究.pdf

1、類脂蛋白沉積癥(lipoidproteinosis,LP)，又稱為皮膚粘膜透明變性，由Urbach和Wiethe于1929年首次報(bào)道，是一種罕見的常染色體隱性遺傳病。臨床表現(xiàn)以聲音嘶啞、眼瞼串珠狀半透明丘疹、皮膚粘膜浸潤增厚、顱內(nèi)鈣化等為主要特征，嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致患者窒息死亡。2002年，Hamada等通過對6個(gè)不同國家的LP家系進(jìn)行基因連鎖分析，首次將其定位于染色體1q21，并進(jìn)一步證明LP是由位于染色體1q21的細(xì)胞外基質(zhì)蛋白1(ext

2、racellularmatrixprotein1，ECM1)基因突變所致。之后，Hamada等又對另外10個(gè)LP家系進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)一般每個(gè)家系擁有獨(dú)特的ECM1基因突變位點(diǎn)，只有一個(gè)突變位點(diǎn)(507delT)出現(xiàn)在3個(gè)不同的家系中。這些突變包括無義突變、錯(cuò)義突變、框移突變，主要集中在ECM1基因的第6和第7外顯子上，大部分患者的突變?yōu)榧兒献?，只?個(gè)家系的患者為遺傳復(fù)合體。 ECM1是一種糖蛋白，目前功能尚不十分明確，文獻(xiàn)報(bào)道

3、可能與表皮細(xì)胞分化、真表皮連接、血管內(nèi)皮細(xì)胞增生及骨生成等有關(guān)。它的特點(diǎn)為含有典型的CC-(X7-10)-C結(jié)構(gòu)，這種結(jié)構(gòu)還存在于血清白蛋白中，可形成雙環(huán)，在蛋白與蛋白的連接上起重要作用。最近的一項(xiàng)研究表明ECM1與基底膜蛋白聚糖相連接，而基底膜蛋白聚糖又與纖連蛋白、層粘蛋白、Ⅳ型膠原、血小板生長因子7及成纖維細(xì)胞生長因子等真皮中重要的蛋白連接，因此推測ECM1的減少或缺失將導(dǎo)致這種蛋白網(wǎng)絡(luò)的紊亂，從而影響這些蛋白的功能，導(dǎo)致真皮結(jié)構(gòu)發(fā)

4、生異常而發(fā)病。人ECM1共有3種不同的剪接異構(gòu)體ECM1a、ECM1b和ECM1c，ECM1基因不同外顯子的突變，可導(dǎo)致不同的剪接異構(gòu)體缺失，這與疾病嚴(yán)重程度有一定關(guān)系。ECM1單克隆抗體免疫組化實(shí)驗(yàn)證實(shí)，患者皮膚標(biāo)本中的ECM1蛋白表達(dá)量遠(yuǎn)少于正常人，甚至缺失。 目前，國外文獻(xiàn)中約有250多例LP的病例報(bào)告，國內(nèi)文獻(xiàn)僅有5例該病的病例報(bào)告，尚無LP基因方面的研究。該課題對漢族一非近親結(jié)婚的LP家系進(jìn)行基因突變的研究，有助于徹底

5、闡明其病變的分子機(jī)制，并為將來開展的基因診斷、產(chǎn)前診斷及基因治療等提供理論依據(jù)。 研究的目的: (1)尋找該LP家系ECM1基因突變位點(diǎn)。 (2)分析該LP家系ECM1基因突變的遺傳情況。 (3)探討該LP家系臨床表現(xiàn)、基因突變的特點(diǎn)，初步觀察基因型-表型之間關(guān)系。 方法: 獲得知情同意后，抽取先證者，先證者父母、子女，先證者同胞及其子女的外周血常規(guī)抗凝，采用改良的酚、氯仿抽提方法提取基因

6、組DNA；采用PCR方法擴(kuò)增出ECM1基因的11個(gè)外顯子，凝膠電泳檢測PCR結(jié)果；用PCR產(chǎn)物純化試劑盒純化PCR產(chǎn)物；對純化后的PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序反應(yīng)后，應(yīng)用DNA測序儀進(jìn)行雙向測序，直接檢測ECM1基因存在的突變；正常對照組取自復(fù)旦大學(xué)遺傳所保存的30份正常漢人基因組DNA樣品。 結(jié)果:(1)直接測序發(fā)現(xiàn)患者為遺傳復(fù)合體，ECM1的兩個(gè)等位基因分別存在錯(cuò)義突變位點(diǎn)和無義突變位點(diǎn)。其中錯(cuò)義突變是ECM1基因的第6外顯子中第22

7、0位密碼子TGC突變?yōu)镚GC，導(dǎo)致半胱氨酸(C)突變?yōu)楦拾彼?G)，命名為C220G。無義突變是第10外顯子中的第476位密碼子CGA突變?yōu)門GA，即精氨酸為終止密碼子代替，導(dǎo)致蛋白翻譯的提前結(jié)束，命名為R476X。所有突變位點(diǎn)均由雙向測序證實(shí)。在30個(gè)正常漢人的ECM1基因中未發(fā)現(xiàn)有突變;(2)患者父親為C220G突變的攜帶者，而母親為R476X突變的攜帶者，患者子女、同胞及同胞子女中大部分為C220G突變或R476X突變的攜帶者。