Alport綜合癥臨床病理分析及COL4A5基因突變的研究.pdf

1、目的： Alport綜合征(Alport syndrome，AS)是一種進(jìn)行性遺傳性腎炎，常伴有眼和耳部異常，是由Ⅳ型膠原編碼基因突變導(dǎo)致的一種基底膜病。Ⅳ型膠原a3～a6鏈編碼基因(Ⅳ callagen gene encoding a3～6 chain，COLAA3℃OL4A6)是AS的致病基因，其中編碼Ⅳ型膠原a5鏈的基因COL4A5與性連鎖遺傳AS(X—linked AS，XLAS)的發(fā)生密切相關(guān)，而常染色體遺傳AS(a

2、utosomal recessive inheritance，ARAS；autosomal dominant inheritance，ADAS)則與位于2號常染色體上編碼Ⅳ型膠a3、a4鏈的基因COL4A3、COL4A4有關(guān)。在臨床上出現(xiàn)血尿的遺傳性腎臟疾病中AS較常見，來自美國部分地區(qū)的資料顯示：AS基因頻率大約為1：5000～10000。國外腎活檢標(biāo)本中AS占1.6％～4％，我國的腎活檢病理研究報(bào)告中0.73％～1.2％的患者被診斷

3、為AS。AS臨床表現(xiàn)多樣，典型患者具有家族史，表現(xiàn)為血尿、蛋白尿、進(jìn)行性腎功能不全伴眼耳病變，但相當(dāng)一部分患者臨床表現(xiàn)極不典型，可僅表現(xiàn)為鏡下血尿和/或蛋白尿。國內(nèi)外AS患者的臨床特征也有差別，有資料顯示，我國AS患者在臨床上具有蛋白尿表現(xiàn)較重，耳聾、眼部異常的發(fā)生率較高，青少年型較多等特點(diǎn)。因此，應(yīng)用有效的篩查手段，在我國不同地區(qū)開展AS篩查以逐步建立起國內(nèi)AS患者的臨床資料庫，具有重要的意義；而進(jìn)行AS患者基因突變的研究可以在分子水

4、平上了解AS的發(fā)病機(jī)理、明確AS基因型和臨床表型的對應(yīng)關(guān)系，也能為將來開展產(chǎn)前診斷和基因治療打下基礎(chǔ)。本研究我們首先開展AS的臨床篩查，對AS確診和疑診病例的臨床病理特點(diǎn)進(jìn)行分析，同時(shí)總結(jié)AS的篩查經(jīng)驗(yàn)，初步探討臨床上篩查AS的有效手段。并在此基礎(chǔ)上展開AS家系的調(diào)查，對XLAS家系進(jìn)行COL4A5基因突變的檢測，進(jìn)一步豐富AS的基因突變庫。 方法： 1、選取我科住院患者作為篩查對象，制定篩查患者的入選條件。將腎活檢光鏡

5、下六胺銀染色(PASM)著色異常作為入選條件之一，對重點(diǎn)病例進(jìn)一步行腎小球基底膜(glomerular basement membrane，GBM)Ⅳ型膠原α鏈的間接免疫熒光染色(indirect immunofluorescence，iFI)和電鏡檢查。參考Flinter診斷標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)合GBMⅣ型膠原α鏈iFI結(jié)果建立AS確診及疑診標(biāo)準(zhǔn)，對篩查出的AS確診及疑診病例的臨床病理特點(diǎn)進(jìn)行總結(jié)分析。 2、通過一例AS先證者對其家系展開

6、調(diào)查，繪制家系圖譜；在22名家系成員中進(jìn)行臨床資料與實(shí)驗(yàn)標(biāo)本的收集。 3、酚抽提法提取－XLAS家系中AS先證者及其母親的外周血白細(xì)胞基因組DNA，采用PCR方法擴(kuò)增COL4A5基因全部51個(gè)外顯子及其臨近的內(nèi)含子。應(yīng)用3130 Genetic Analyser測序儀對明確擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物進(jìn)行直接測序，尋找COLAA5基因突變。 結(jié)果： 1、本研究共有108例患者入選進(jìn)行AS篩查。在108例AS篩查病例中篩查出5

7、例AS確診病例，占篩查總數(shù)的4.6％；4例AS疑診病例，占篩查總數(shù)的3.7％。9例確診及疑診病例全部具有血尿家族史，普遍對一般的對癥治療反應(yīng)差。其中5例確診病例表現(xiàn)出發(fā)病年齡早、腎功能損害重、合并有蛋白尿以及耳聾比例高的臨床特點(diǎn)；4例疑診病例腎功能均正常，3例女性表現(xiàn)為持續(xù)性尿檢異常。 2、行腎活檢的7例AS確診及疑診病例腎活檢病理診斷包括：輕度系膜增生性腎小球腎炎、微小病變及局灶節(jié)段硬化，光鏡下全部具有PASM著色異常的特點(diǎn)；

8、98例行腎活檢的篩查病例中，PASM著色異常者21例。普通免疫熒光多為陰性，GBMⅣ型膠原iFI結(jié)果，男患均為陰性，女患α3、α5鏈呈不連續(xù)染色；電鏡下確診及疑診病例GBM多呈彌漫性厚薄不均改變，2例伴有分層、撕裂，一例女性疑診病例表現(xiàn)為GBM彌漫性變薄。 3、本研究對一例AS先證者進(jìn)行的家系調(diào)查結(jié)果顯示，該家系中共有10例患者，男性4例，女性6例，分布于四代當(dāng)中；4例男性患者發(fā)病均早，進(jìn)入終末期腎衰竭(end stage re

9、nal disease，ESRD)的時(shí)間早，已有3例死于尿毒癥；而6例女性患者中僅2例出現(xiàn)腎功能不全，臨床癥狀輕；男性患者不傳男，女性患者傳男也傳女。家系調(diào)查還發(fā)現(xiàn)，先證者的母親20歲時(shí)即發(fā)現(xiàn)雙腎縮小，而腎功能長期正常，為臨床上少見病例。 4、COL4A5基因的測序結(jié)果：先證者在COL4A5基因第51外顯子的5222位點(diǎn)C堿基被T堿基所替換(C5222T)，導(dǎo)致第1674號密碼子由精氨酸變成了終止密碼子(CGA→UGA，R167

10、4Term)；先證者母親在5222位點(diǎn)表現(xiàn)為T、C堿基雜合。上述結(jié)果經(jīng)重復(fù)測序和雙向測序得到驗(yàn)證，在正常人的對照中均未發(fā)現(xiàn)5222位點(diǎn)存在堿基替換。 結(jié)論： 1、本研究所建立的篩查條件能夠在臨床上進(jìn)行有效的AS篩查，篩查出的AS確診和疑診病例，豐富了本地區(qū)AS患者的臨床病理資料。 2、對于臨床上尿檢異常的患者，腎活檢組織光鏡下PASM著色異常這一病理特點(diǎn)在AS的臨床篩查中具有重要意義。 3、本研究中所調(diào)查