縫隙連接在長QT綜合征室性心律失常發(fā)生中的作用及其機制研究.pdf

1、長QT綜合征(Long QT Syndrome, LQTS)是一種先天遺傳性，或者后天獲得的心臟復極延遲的疾病。長QT綜合征表現(xiàn)為心電圖上QT間期延長，它可以引起室性早搏及尖端扭轉(zhuǎn)性室速(Torsade de Pointes，TdP)等致命性的心律失常，心源性暈厥和猝死為長QT綜合征常見并發(fā)癥。長QT綜合征患者心電圖上QT間期異常延長，臨床上長QT綜合征患者反復發(fā)生心源性暈厥、并常導致猝死的發(fā)生。
　　 近年來許多研究表明，除了

2、心臟復極時程的延長以外，跨室壁復極離散度（transmurAldispersion of repolarization，TDR）的增加在長QT綜合征早期后除極（early afterdepolarization，EAD）的產(chǎn)生，以及心律失常TdP的誘發(fā)和維持中也起著重要作用。長QT綜合征中增大的TDR可使得EAD能夠跨室壁傳導，EAD跨室壁傳導導致心臟的觸發(fā)活動（比如R-on-T期前收縮）和致命性的心律失常TdP的產(chǎn)生。長QT綜合征TD

3、R的增加同時也可以通過二相折返的機制來維持TdP的發(fā)生。心臟各層心肌細胞有著顯著的電生理特性和功能上的差異，近年來一些研究表明心室壁各層心肌細胞表面離子通道表達和功能的差異，使得跨室壁復極離散度異常增加。
　　 心臟各層心肌細胞有著顯著的電生理特性和功能上的差異導致了跨室壁復極離散度的形成，而心肌細胞間之間通過縫隙連接耦連。心肌細胞的縫隙連接位于閏盤處，動作電位通過縫隙連接從一個細胞擴布到相鄰的細胞。跨膜離子及小分子物質(zhì)可通過心

4、肌細胞的縫隙連接直接交換, 心肌細胞的縫隙連接在維持正常的心臟節(jié)律和細胞間的代謝物交換方面扮演著重要角色。由于整體心臟中心肌細胞間存在縫隙連接，小分子物質(zhì)通過縫隙連接順著電化學梯度在心肌細胞間傳遞，從而減少了心肌細胞間的電生理異質(zhì)性。在整體心臟中，由于心肌細胞間良好的縫隙連接耦連，使得跨室壁復極的差異小于單個心肌細胞間動作電位時程的差異。近來有研究結(jié)果顯示，在正常和心衰的心臟中，縫隙連接蛋白Cx43的表達、分布和磷酸化均影響了跨室壁復極

5、的異質(zhì)性?？p隙連接蛋白磷酸化狀態(tài)的改變可影響縫隙連接通道的開放和代謝，造成縫隙連接的解耦連和功能下降。Carbenoxolone（縫隙連接解耦連劑）可增加復極離散度，而增加各層心肌細胞間縫隙連接的耦連，可減少跨室壁復極時程的差異?？p隙連接耦連增強劑抗心律失常肽AAP10和HP-5能夠增加縫隙連接功能，進而減少動作電位時程的離散度。增加心肌細胞間縫隙連接的耦連，可以防止病理狀態(tài)跨室壁復極離散度的異常增加。
　　 心肌肥厚和心衰等多

6、種心臟疾病的跨室壁復極離散度增加，同時其伴有心肌細胞間縫隙連接失耦連。這些研究結(jié)果表明改變心肌細胞間縫隙連接耦連，可能影響心臟各層心肌細胞間復極特性的差異的大小。因而我們推測增加心臟心肌細胞間縫隙連接的耦連，可以減少跨室壁復極離散度，進而預防長QT綜合征室性心律失常的發(fā)生。本研究檢測了縫隙連接激動劑抗心律失常肽(AAP10)對兔LQT3和犬LQT2模型跨室壁復極離散度和室性心律失常的影響并探討其作用機制。
　　 第一部分抗心律失

7、常肽對兔LQT3模型縫隙連接耦連和室性心律失常的影響
　　 目的：跨室壁復極離散度（transmurAldispersion of repolarization，TDR）的增加可導致長QT綜合征心律失常的發(fā)生。 心肌細胞的縫隙連接也參與了跨室壁復極離散度的形成和維持。本實驗研究了縫隙連接激動劑抗心律失常肽(AAP10)，對兔LQT3模型縫隙連接磷酸化，以及室性心律失常的影響并探討其作用機制。
　　 方法：心肌細胞鈉通道開

8、放劑?？舅谹TX-II (20Nm, Calbiochem Corp., La Jolla, CA, USA)和兔左室楔型心肌塊用于建立LQT3模型。抗心律失常肽AAP10(縫隙連接激動劑，Chinese Peptide Co., Hangzhou, Zhejiang, China) 用于增加心肌細胞間縫隙連接耦連。采用浮置玻璃微電極法，同步記錄心外膜、心內(nèi)膜心肌細胞跨膜動作電位，同時記錄跨室壁心電圖。免疫印跡法（Western bl

9、ot）檢測心肌細胞縫隙連接蛋白43 (Connexin43， Cx43)去磷酸化水平的變化。
　　 基礎步長1000ms起搏1小時（電生理穩(wěn)定），藥物均溶解于臺氏液，通過左室楔型心肌組織塊冠狀動脈插管灌流。左室楔型心肌組織塊隨機分為正常組、LQT3組、AAP-100nM和AAP-500nM干預組：正常組灌流正常臺式液（n=10）、LQT3組灌流含20Nm ATX-II的臺式液（n=10）、AAP-100nM干預組灌流含20Nm

10、ATX-II和100Nm AAP10的臺式液（n=10）、AAP-500nM干預組灌流含20Nm ATX-II和500Nm AAP10的臺式液（n=10）。
　　 在基礎狀態(tài)下、AAP10預處理時和灌流ATX-II的LQT3階段，觀察并記錄左室楔型心肌組織塊自發(fā)性心律失常，以及程序刺激誘發(fā)的左室楔型心肌組織塊心律失常。QT間期為起搏信號到T波下降支與基線交叉點間的距離；動作電位復極90％時程(APD90)為動作電位0期到復極至9

11、0％振幅的時程；跨室壁復極離散度（TDR）為同一心搏心內(nèi)膜和心外膜復極時間差值。
　　 結(jié)論：縫隙連接激動劑AAP10防止Cx43去磷酸化，減少了兔LQT3模型的跨室壁復極離散度和心律失常發(fā)生率，說明兔LQT3模型的縫隙連接可能參與了跨室壁復極離散度的形成。
　　 第二部分抗心律失常肽對犬LQT2模型縫隙連接重構(gòu)和室性心律失常的影響
　　 目的：跨室壁復極離散度（transmurAldispersion of r

12、epolarization，TDR）的增加可導致長QT綜合征心律失常的發(fā)生。 心肌細胞的縫隙連接也參與了跨室壁復極離散度的形成和維持。本實驗研究了縫隙連接激動劑抗心律失常肽(AAP10)，對犬LQT2模型縫隙連接磷酸化，以及室性心律失常的影響并探討其作用機制。
　　 方法：應用心肌細胞Ikr通道阻斷劑d-sotalol (100Μm, Sigma, St. Louis, MO, USA)在犬左室楔型心肌塊建立LQT2模型?？剐穆?/p>

13、失常肽AAP10(縫隙連接激動劑，Chinese Peptide Co., Hangzhou, Zhejiang, China) 用于增加心肌細胞間縫隙連接耦連。采用浮置玻璃微電極法同步記錄心內(nèi)膜、中層（M細胞）和心外膜心肌細胞跨膜動作電位及跨室壁心電圖。免疫印跡法（Western blot）檢測心肌細胞縫隙連接蛋白43 (Connexin43， Cx43)總的Cx43和去磷酸化Cx43水平的變化。應用熒光免疫組化技術檢測上述各組心肌細

14、胞縫隙連接蛋白Cx43表達、空間分布和磷酸化水平的改變。
　　 基礎步長1000ms起搏1小時（電生理穩(wěn)定），藥物均溶解于臺氏液，通過左室楔型心肌組織塊冠狀動脈插管灌流。隨機分為正常組、LQT2組和AAP10干預組：正常組（n=10）灌流正常臺式液、LQT2組（n=10）灌流含100Μm d-sotalol的臺式液、AAP10干預組（n=10）灌流含100Μm d-sotalol和500Nm AAP10的臺式液。
　　

15、在基礎狀態(tài)、AAP10預處理階段和灌流d-sotalol階段，觀察并記錄左室楔型心肌組織塊自發(fā)性心律失常，以及程序刺激誘發(fā)的左室楔型心肌組織塊心律失常。QT間期為起搏信號到T波下降支與基線交叉點間的距離；動作電位復極90％時程(APD90)為動作電位0期到復極至90％振幅的時程；TDR為同一心搏M細胞和心外膜復極時間差值。
　　 結(jié)論：縫隙連接激動劑AAP10防止Cx43去磷酸化，減少了犬LQT2模型的跨室壁復極離散度和心律失常