2023年全國碩士研究生考試考研英語一試題真題(含答案詳解+作文范文)_第1頁
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文檔簡介

1、本論文建立了Caco-2體外腸道吸收模型和穩(wěn)定的高表達(dá)P-糖蛋白細(xì)胞系。建立了耐阿霉素的K562/ADR細(xì)胞,并用雙向電泳和質(zhì)譜尋找與K562/ADR細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制相關(guān)的蛋白。研究了普萘洛爾對映體在Caco-2細(xì)胞單層的轉(zhuǎn)運(yùn)和積聚;在K562和K562/ADR細(xì)胞內(nèi)的積聚??疾炝算y杏黃酮苷元在Caco-2細(xì)胞單層的轉(zhuǎn)運(yùn)以及與P-糖蛋白的相互作用。具體研究如下: 第一部分Caco-2體外吸收模型的建立和應(yīng)用 Caco-2細(xì)胞

2、種于TranswellTM板培養(yǎng)21天,跨膜電阻達(dá)500Ωcm2左右;LuciferyellowCH的Papp為1.65±0.79×10-7cm/s,普萘洛爾的Papp為1.42±0.18×10-5cm/s;透射電鏡觀察細(xì)胞單層有緊密連接結(jié)構(gòu),微絨毛分化良好,多而致密;分化的另一標(biāo)志物堿性磷酸酶的表達(dá)很高;P-糖蛋白也有表達(dá)。 銀杏黃酮苷元槲皮素、山奈酚和異鼠李素在Caco-2細(xì)胞單層的轉(zhuǎn)運(yùn)研究發(fā)現(xiàn),這三種化合物都存在外排現(xiàn)象,

3、也就是B側(cè)到A側(cè)的轉(zhuǎn)運(yùn)大于A側(cè)到B側(cè)(槲皮素p<0.01,山奈酚和異鼠李素p<0.001,Student'st-test)。 反相高效液相色譜檢測轉(zhuǎn)運(yùn)液中普萘洛爾(PPL)單個(gè)對映體的方法建立。流動相為甲醇-乙腈-pH4.0磷酸緩沖液(10:45:45,v/v/v);流速為0.9ml/min;柱溫:25℃;檢測波長是220nm。普萘洛爾對映體在0.2-20μmol/L范圍內(nèi)線性良好,回收率為98.8-101.8﹪。檢測限均為0.

4、005μmol/L,定量限均為0.2μmol/L(RSD<10﹪)。日內(nèi)、日間精密度的RSD均小于10﹪。 不同濃度的普萘洛爾在Caco-2細(xì)胞的轉(zhuǎn)運(yùn)和積聚的結(jié)果顯示:S-PPL在A側(cè)到B側(cè)的透過要大于R-PPL,但在B側(cè)到A側(cè),R-PPL的透過量要大于S-PPL;普萘洛爾的積聚也有立體選擇性。普萘洛爾A側(cè)到B側(cè)的透過受A側(cè)pH的影響,當(dāng)pH為6.5時(shí),兩對映體的透過均減少。該藥物在Caco-2細(xì)胞內(nèi)的積聚也受pH的影響。普萘洛

5、爾對映體在B側(cè)到A側(cè)的轉(zhuǎn)運(yùn)不受維拉帕米、環(huán)孢菌素A、吲哚美辛、西咪替丁和哇巴因的影響;除了維拉帕米能增加普萘洛爾對映體的積聚外,其余抑制劑對普萘洛爾在Caco-2細(xì)胞的積聚無影響。 第二部分P-糖蛋白高表達(dá)細(xì)胞系的建立和應(yīng)用 質(zhì)粒pMDRA1中的全長MDR1cDNA片斷經(jīng)酶切亞克隆至載體pET-28a(+),重組質(zhì)粒中的全長MDR1cDNA片斷經(jīng)酶切與真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)相連,酶切和DNA測序確認(rèn)表達(dá)載體構(gòu)

6、建正確。質(zhì)粒pcDNA3.1(+)/MDR1通過SuperfectTransfection轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染乳腺癌細(xì)胞Bcap37,經(jīng)G418篩選獲得抗性克隆。所建立的Bcap37/MDR1細(xì)胞與轉(zhuǎn)染了空載體pcDNA3.1(+)的Bcap37細(xì)胞相比,實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR發(fā)現(xiàn)MDR1的mRNA表達(dá)明顯升高,Westernblot表明P-糖蛋白的表達(dá)發(fā)生從無到有的變化,免疫組化顯示P-糖蛋白定位于Bcap37/MDR1細(xì)胞的細(xì)胞膜上。在藥

7、敏試驗(yàn)中,Bcap37/MDR1細(xì)胞對阿霉素和秋水仙堿的敏感性遠(yuǎn)低于對照細(xì)胞。 反相高效液相色譜檢測Bcap37細(xì)胞內(nèi)三種銀杏黃酮苷元槲皮素、山奈酚、異鼠李素的方法建立。流動相為pH2.0磷酸緩沖液-四氫呋喃-甲醇-異丙醇(65:15:10:20,v/v/v/v);流速為0.5ml/min;柱溫為室溫;檢測波長是380nm。三種銀杏黃酮苷元在0.1-1.0μmol/L范圍內(nèi)線性良好,絕對回收率為70﹪左右。槲皮素和山奈酚的檢測限

8、為0.01μmol/L,異鼠李素的檢測限為0.05μmol/L。三種黃酮醇的定量限均為0.1μmol/L(RSD<10﹪)。日內(nèi)、日間精密度的RSD均小于10﹪。 槲皮素、山奈酚、異鼠李素在Bcap37/MDR1細(xì)胞內(nèi)的積聚低于對照細(xì)胞(槲皮素p<0.05,異鼠李素p<0.01,MannWhitneyUtest);當(dāng)與P-糖蛋白抑制劑維拉帕米共孵育,三種黃酮在Bcap37/MDR1細(xì)胞內(nèi)的積聚增加(山奈酚p<0.05,MannW

9、hitneyUtest)。用ATP酶法考察P-糖蛋白與黃酮的相互作用,槲皮素和山奈酚抑制P-糖蛋白的ATP酶活性,而異鼠李素有刺激ATP酶的作用(p<0.05,MannWhitneyUtest)。 第三部分K562耐藥細(xì)胞的建立、應(yīng)用和相關(guān)蛋白表達(dá)改變的研究 將K562細(xì)胞與阿霉素(ADR)共同培養(yǎng),逐漸增加藥物濃度,最后建立耐阿霉素的細(xì)胞K562/ADR。MTT法檢測阿霉素(ADR)、順鉑(DDP)、5-氟尿嘧啶(5-

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