高脂飲食老年大鼠骨骼肌脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)與IR相關(guān)機(jī)制及藥物干預(yù)的研究.pdf

1、流行病學(xué)資料表明，2型糖尿病患病率隨年齡增加而上升。胰島素抵抗(insulin resistance，IR)和胰島β細(xì)胞功能受損是2型糖尿病的主要發(fā)病機(jī)制。 研究發(fā)現(xiàn)，老年內(nèi)臟脂肪增加使2型糖尿病和心血管發(fā)病率增加，其中飲食是重要促發(fā)因素之一。長(zhǎng)期高脂飲食的人群IR和2型糖尿病發(fā)病率明顯高于正常人群。 本課題通過觀察老年大鼠和給予高脂飲食喂養(yǎng)后骨骼肌脂肪酸代謝情況，研究骨骼肌中脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)關(guān)鍵酶FAT/CD36和CPTⅠβ的表達(dá)及

2、胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中PKB和GLUT4的表達(dá)，探索老年大鼠骨骼肌脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)有關(guān)的代謝異常與IR形成的機(jī)制；通過對(duì)高脂喂養(yǎng)老年大鼠羅格列酮藥物干預(yù)，探討羅格列酮改善IR的新機(jī)制，為改善老年IR狀態(tài)、降低糖尿病的發(fā)生和延緩衰老提供一個(gè)新的研究方向。本實(shí)驗(yàn)內(nèi)容主要包括以下四部分： 第一部分高脂飲食對(duì)老年大鼠骨骼肌脂肪酸代謝和胰島素敏感性的影響及羅格列酮的干預(yù)研究 目的：探討老年和高脂飲食及羅格列酮干預(yù)對(duì)大鼠胰島素敏感性和骨骼肌

3、內(nèi)脂質(zhì)的影響，并對(duì)骨骼肌內(nèi)脂質(zhì)與胰島素抵抗進(jìn)行相關(guān)性分析。 方法：22-24月齡老年雄性Wistar大鼠40只隨機(jī)分為2組：老年對(duì)照(OC)組16只、高脂(HF)組24只，4-5月齡青年大鼠16只，為青年對(duì)照組(YC)。對(duì)照組給予基礎(chǔ)飼料，熱量組成：碳水化合物65.5％，脂肪10.3％，蛋白質(zhì)24.2％，總熱量為348kcal/100g；m組給予高脂飼料，其熱量組成：碳水化合物20.1％，脂肪59.8％，蛋白質(zhì)20.1％，總熱量

4、為501kcal/100g；給予老年兩組大鼠每日等熱量投喂飼料，每周稱體重1次，喂養(yǎng)八周。于喂養(yǎng)第四周末心臟采血測(cè)空腹血糖(FBG)，胰島素(INS)。血清甘油三酯(TG)，血清總膽固醇(TC)，游離脂肪酸(FFA)的含量。喂養(yǎng)四周末，每組均隨機(jī)選8只行口服葡萄糖耐量實(shí)驗(yàn)(OGTT)評(píng)價(jià)大鼠對(duì)葡萄糖負(fù)荷的耐受情況，行高胰島素-正葡萄糖鉗夾試驗(yàn)判斷胰島素抵抗情況，判斷造模成功后高脂組隨機(jī)分為2組：高脂組和羅格列酮干預(yù)組(RSG)，每組8只

5、，除繼續(xù)給予高脂飼料外RSG組給予羅格列酮3mg/kg灌胃，高脂組給予等量生理鹽水灌胃，繼續(xù)喂養(yǎng)四周。實(shí)驗(yàn)第八周末，行OGTT實(shí)驗(yàn)和高胰島素-正葡萄糖鉗夾試驗(yàn)評(píng)價(jià)各組胰島素抵抗情況，實(shí)驗(yàn)前抽取血樣用于測(cè)定血清各項(xiàng)指標(biāo)；實(shí)驗(yàn)結(jié)束后頸動(dòng)脈放血處死動(dòng)物，立即取出股四頭肌和脂肪組織放入液氮中冷凍，然后保存于-70℃低溫冰箱。骨骼肌甘油三酯(TGm)經(jīng)氯仿/甲醇抽提后用全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定，骨骼肌長(zhǎng)鏈酯酰輔酶A(LCACoA)用熒光分光光度計(jì)測(cè)定

6、。 結(jié)果： 1. 各組一般項(xiàng)目的比較：與青年組相比，老年組大鼠體重增加，高脂組和羅格列酮干預(yù)組體重與老年組相比變化不明顯，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p>0.05)。與青年組相比，老年組空腹胰島素、空腹血糖和游離脂肪酸在喂養(yǎng)第八周均升高；與老年組比較，高脂組空腹胰島素、空腹血糖、游離脂肪酸、總膽固醇和甘油三酯明顯升高；羅格列酮干預(yù)組空腹胰島素、空腹血糖、游離脂肪酸、總膽固醇和甘油三酯與高脂組比較均下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.

7、05或p<0.01)。 2. 在第四周和第八周，與青年組相比，老年組TGm和LCACoA含量明顯升高(p<0.05)；與老年組相比，高脂組TGm和LCACoA含量進(jìn)一步明顯升高，且隨喂養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，高脂組喂養(yǎng)第八周TGm和LCACoA含量明顯高于第四周(p<0.05或p<0.01)；羅格列酮干預(yù)組TGm和LCACoA含量與高脂組相比明顯下降(p<0.05或p<0.01)。 3. 胰島素抵抗的評(píng)價(jià)：在喂養(yǎng)第四周和第八周，與

8、青年組相比，老年組鉗夾實(shí)驗(yàn)的葡萄糖輸注率降低(p<0.01)；與老年組相比，高脂組葡萄糖輸注率明顯下降；隨喂養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，第八周時(shí)高脂組內(nèi)葡萄糖輸注率與第四周相比明顯下降(p<0.01)；羅格列酮干預(yù)組葡萄糖輸注率與高脂組相比明顯升高(p<0.01)。 4. OGTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果：與青年組比較，無論第四周或第八周老年組大鼠60'、120'血糖和葡萄糖曲線下面積(AUC)均升高(p<0.05或p<0.01)。與老年組比較，高脂喂養(yǎng)第四周

9、120'血糖和AUC升高，高脂喂養(yǎng)第八周各時(shí)間點(diǎn)血糖和AUC均升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.01)；高脂喂養(yǎng)第八周0'、60'、120'血糖和AUC明顯高于第四周，羅格列酮干預(yù)組各時(shí)間點(diǎn)血糖和AUC均下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05或p<0.01)。 5. 相關(guān)結(jié)果表明：葡萄糖輸注率與空腹胰島素、游離脂肪酸和骨骼肌甘油三酯和長(zhǎng)鏈脂酰輔酶A明顯負(fù)相關(guān)(p<0.05或p<0.01)。 結(jié)論： 1. 老年大鼠骨骼

10、肌甘油三酯和長(zhǎng)鏈脂酰輔酶A含量明顯高于青年大鼠，葡萄糖輸注率和口服糖耐量在老年組明顯減低，表明老年大鼠更易發(fā)生骨骼肌脂肪堆積和胰島素抵抗。 2. 高脂飲食可誘導(dǎo)老年大鼠骨骼肌甘油三酯和長(zhǎng)鏈脂酰輔酶A含量進(jìn)一步升高，葡萄糖輸注率和口服糖耐量進(jìn)一步降低，說明高脂飲食可加重老年骨骼肌脂肪酸代謝異常及胰島素抵抗。 3. 相關(guān)分析表明葡萄糖輸注率和骨骼肌脂質(zhì)明顯負(fù)相關(guān)，說明脂代謝紊亂參與了年齡和飲食誘導(dǎo)的胰島素抵抗的發(fā)生。

11、 4. 羅格列酮可以降低高脂誘導(dǎo)老年胰島素抵抗大鼠骨骼肌甘油三酯和長(zhǎng)鏈脂酰輔酶A含量，使OGTT各點(diǎn)血糖和AUC下降及增加葡萄糖輸注率，改善胰島素抵抗。 第二部分高脂飲食和羅格列酮干預(yù)對(duì)老年大鼠骨骼肌FAT/CD36和CPT Ⅰβ表達(dá)的影響 目的：探討是否隨年齡增長(zhǎng)及高脂的環(huán)境因素影響了骨骼肌脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)的關(guān)鍵酶FAT/CD36和CPTⅠβ的表達(dá)及與骨骼肌脂質(zhì)的相關(guān)性研究，觀察羅格列酮干預(yù)對(duì)FAT/CD36和CPTⅠβ表達(dá)

12、的影響。 方法：動(dòng)物分組及標(biāo)本取得同第一部分。骨骼肌FAT/CD36mRNA表達(dá)采用實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR分析技術(shù)，CPTⅠβmRNA表達(dá)采用半定量RT-PCR分析技術(shù)，采用TRIZOL提取組織總RNA，鑒定RNA完整性，測(cè)定其在260nm和280nm的吸光度值(OD)。以完整性較好且OD260/OD280在1.8～2.0的RNA進(jìn)行RT-PCR。Western-blot法分析FAT/CD36蛋白表達(dá)。 結(jié)論：

13、 1. 與青年組相比，老年組大鼠骨骼肌細(xì)胞FAT/CD36mRNA和蛋白表達(dá)升高可能是老年組易發(fā)生脂質(zhì)沉積的原因。 2. 高脂飲食可使骨骼肌FAT/CD36mRNA和蛋白表達(dá)明顯增加和CPTⅠβmRNA表達(dá)下降，可能導(dǎo)致飲食誘導(dǎo)骨骼肌內(nèi)脂質(zhì)沉積原因之一。 3. 骨骼肌內(nèi)長(zhǎng)鏈酯酰輔酶A與FAT/CD36mRNA表達(dá)呈正相關(guān)，與CPTⅠβmRNA表達(dá)負(fù)相關(guān)，說明老年高脂大鼠骨骼肌脂質(zhì)堆積與脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)關(guān)鍵酶的表達(dá)異常有關(guān)。

14、 4. 羅格列酮干預(yù)使骨骼肌FAT/CD36mRNA和蛋白表達(dá)降低和CPTⅠβmRNA表達(dá)升高，可能相應(yīng)減少骨骼肌脂質(zhì)堆積，改善胰島素抵抗。 第三部分老年高脂飲食大鼠骨骼肌脂肪酸含量與PKB、GLUT4表達(dá)的相關(guān)性研究及羅格列酮干預(yù)影響 目的：探討老年和高脂環(huán)境因素對(duì)骨骼肌PKB和GLUT4mRNA和蛋白表達(dá)影響及羅格列酮干預(yù)的影響，并對(duì)骨骼肌內(nèi)脂質(zhì)與PKB和GLUT4表達(dá)的量進(jìn)行了相關(guān)分析，以了解骨骼肌內(nèi)脂質(zhì)對(duì)胰島

15、素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的影響。 方法：動(dòng)物分組及標(biāo)本取得同第一部分。骨骼肌PKB和GLUT4mRNA表達(dá)采用實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR分析技術(shù)，PKB和GLUT4蛋白表達(dá)用Western-blot分析。 結(jié)論：1. 與青年組相比，老年組大鼠骨骼肌細(xì)胞PKBmRNA和蛋白表達(dá)下降，GLUT4mRNA和蛋白表達(dá)也下降，可能是老年組易出現(xiàn)胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)異常，胰島素抵抗的發(fā)生增加。 2. 高脂飲食可誘導(dǎo)PKBmRNA和蛋白表達(dá)及GLU

16、T4mRNA和蛋白表達(dá)進(jìn)一步下降，說明高脂環(huán)境因素可通過影響胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的關(guān)鍵酶而促進(jìn)胰島素抵抗的形成。 3. 相關(guān)分析表明，PKBmRNA表達(dá)的量與葡萄糖輸注率明顯正相關(guān)，GLUT4mRNA表達(dá)的量與骨骼肌內(nèi)LCACoA負(fù)相關(guān)，和葡萄糖輸注率正相關(guān)，說明骨骼肌內(nèi)脂質(zhì)通過影響胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的關(guān)鍵酶參與胰島素抵抗的形成。 4. 羅格列酮干預(yù)可使高脂喂養(yǎng)老年大鼠骨骼肌PKBmRNA和蛋白表達(dá)及GLUT4mRNA和蛋白表

17、達(dá)升高，可能是改善老年胰島素抵抗的機(jī)制之一。 第四部分高脂飲食和羅格列酮干預(yù)對(duì)老年大鼠脂肪和骨骼肌PPARγ表達(dá)的影響 目的：通過觀察高脂喂養(yǎng)老年大鼠脂肪和骨骼肌組織PPARγ的表達(dá)情況，探討高脂飲食老年大鼠骨骼肌脂質(zhì)代謝紊亂和羅格列酮改善胰島素抵抗的機(jī)制。 方法：動(dòng)物分組及標(biāo)本取得同第一部分。脂肪和骨骼肌組織PPARγmRNA表達(dá)采用實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR技術(shù)，脂肪和骨骼肌組織PPAR蛋白表達(dá)用Western

18、-blot分析。 結(jié)論：1. 與青年組相比，老年組大鼠脂肪組織PPARγ mRNA和蛋白表達(dá)下降可能是老年脂肪酸代謝紊亂胰島素抵抗發(fā)生增加原因之一。 2. 高脂飲食可誘導(dǎo)老年大鼠脂肪組織和骨骼肌組織PPARγmRNA和蛋白表達(dá)下降，可能參與飲食誘導(dǎo)的骨骼肌脂肪酸代謝異常和胰島素抵抗的形成。 3. 羅格列酮干預(yù)可使高脂喂養(yǎng)老年大鼠骨骼肌和脂肪組織PPARγ mRNA。和蛋白表達(dá)升高，可能是改善老年胰島素抵抗的機(jī)制之