白血病小鼠微移植模型建立及其相關(guān)機(jī)制初步研究.pdf

1、目的：建立白血病小鼠H-2全不相合微移植模型并進(jìn)行鑒定，通過(guò)此模型驗(yàn)證微移植具有促造血、抗白血病等作用，同時(shí)避免移植物抗宿主病，并初步探討與上述作用相關(guān)的機(jī)制。
　　內(nèi)容：1、建立小鼠白血病模型根據(jù)本研究室已成熟的方法及參考相關(guān)文獻(xiàn)建立小鼠急性粒單核細(xì)胞(M4)白血病模型并鑒定;2、白血病小鼠化療方案的優(yōu)化采用不同的MA(米托蒽醌+阿糖胞苷)化療方案，通過(guò)比較早期死亡率、骨髓抑制等指標(biāo)來(lái)選擇微移植中的化療方案;3、回輸供體動(dòng)員的脾

2、細(xì)胞量的優(yōu)化及微移植模型的鑒定回輸不同的供體動(dòng)員后脾細(xì)胞，通過(guò)比較早期死亡率、促白細(xì)胞恢復(fù)及相同時(shí)間點(diǎn)白血病負(fù)荷等，選擇微移植中合適的供體細(xì)胞量。微移植模型建立后在供體嵌合及GVHD兩方面對(duì)模型進(jìn)行鑒定;4、微移植促造血、抗白血病效應(yīng)同時(shí)避免GVHD機(jī)制的初步研究通過(guò)觀察白血病小鼠微移植后一般情況、供體嵌合體變化規(guī)律、造血恢復(fù)情況、白血病負(fù)荷變化、細(xì)胞因子及骨髓、肝、脾及腸道病理變化等初步研究探討微移植發(fā)揮上述作用的相關(guān)機(jī)制。
　

3、　方法：受鼠為雌性BALB/c小鼠(H2Kd/d)，供鼠為雄性C57小鼠（H2Kb/b），供受體H-2全不相合。首先建立小鼠白血病模型，雌性BALB/c小鼠隨機(jī)分成2組(n=10)，白血病模型組和正常對(duì)照組，白血病模型組小鼠經(jīng)尾靜脈接種約1×106個(gè)WEHI-3細(xì)胞（小鼠急性髓系白血病M4細(xì)胞株），正常對(duì)照組接種等量生理鹽水。從外周血涂片、骨髓形態(tài)學(xué)、免疫組化、免疫表型及病理組織學(xué)等方面診斷發(fā)病情況，并記錄死亡情況。其次進(jìn)行MA化療方案

4、的優(yōu)化(n=8)，受鼠接種1×106/個(gè)WEHI-3細(xì)胞后，隨機(jī)分成3組（米托蒽醌2mg/kg×1d+阿糖胞苷200mg/kg×3d、米托蒽醌4mg/kg×1d+阿糖胞苷200mg/kg×3d、米托蒽醌8mg/kg×1d+阿糖胞苷200mg/kg×3d)，通過(guò)早期死亡率及骨髓抑制情況選取合適化療方案。然后進(jìn)行回輸供體細(xì)胞量的優(yōu)化，供鼠自微移植-5天開(kāi)始接受皮下rhG-CSF(100μ g/kg)的動(dòng)員，q12h×5d，末次動(dòng)員12小時(shí)后

5、進(jìn)行脾單個(gè)核細(xì)胞的提取。接種白血病細(xì)胞的受鼠化療后給予回輸不同數(shù)量的經(jīng)動(dòng)員后的供體脾單個(gè)核細(xì)胞，細(xì)胞量分別為(3、6、12)×107個(gè)(n=12)，比較各組早期死亡率、促白細(xì)胞恢復(fù)及白血病負(fù)荷情況，來(lái)選擇合適的供體細(xì)胞量。微移植模型建立后從供體嵌合率、GVHD發(fā)生情況量方面對(duì)模型進(jìn)行鑒定。最后比較微移植組和單純化療對(duì)照組的早期死亡率、促造血恢復(fù)、相同時(shí)間點(diǎn)的白血病負(fù)荷、生存情況等，以驗(yàn)證微移植的療效。對(duì)細(xì)胞因子、供體嵌合等進(jìn)行檢測(cè)，初步

6、研究微移植發(fā)揮相關(guān)作用的機(jī)制。
　　結(jié)果小鼠白血病模型建立:白血病模型組小鼠在2周之內(nèi)全部發(fā)病，骨髓中原始細(xì)胞比例占NEC（非紅有核計(jì)數(shù)）的30％以上，生存期為17-35天。接種后第3周，白血病模型組小鼠外周血白細(xì)胞最高可達(dá)85.09×109/L，與正常對(duì)照組小鼠差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。骨髓細(xì)胞免疫組化提示POX(+)、CE(+)、NSE(+)、NaF(-)。發(fā)病小鼠各器官中可見(jiàn)大量白血病細(xì)胞浸潤(rùn)。結(jié)果與本實(shí)驗(yàn)室及相關(guān)文

7、獻(xiàn)結(jié)果一致，說(shuō)明此白血病模型較為穩(wěn)定?；煼桨竷?yōu)化:3組化療方案(①M(fèi)2mg/kg×1d+A200mg/kg×3d、②M4mg/kg×1d+A200mg/kg×3d、③M8mg/kg×1d+A200mg/kg×3d)早期死亡率分別為0、25％、100％，（①②死亡差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），①②與③死亡率差異顯著(P＜0.01);在骨髓抑制方面，②比①停化療第1-4天白細(xì)胞低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，綜合死亡率和骨髓抑

8、制結(jié)果選取②MA(M4mg/kg×1d+A200mg/kg×3d)作為化療方案。回輸細(xì)胞量選擇方面:早期死亡率，化療對(duì)照組為25％，(3、6、12)×107組分別為16.67％、8.33％、8.33％，四組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);白細(xì)胞恢復(fù)情況，(3、6)×107組明顯優(yōu)于12×107組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);白血病負(fù)荷檢測(cè)結(jié)果顯示(3、6、12)×107組較化療對(duì)照組負(fù)荷低，有顯著性差異(P＜0.01)，(6

9、、12)×107較3×107組低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，6×107與12×107差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。綜合早期死亡率、促白細(xì)胞恢復(fù)和白血病負(fù)荷結(jié)果選取6×107作為回輸?shù)墓w細(xì)胞量，后續(xù)的實(shí)驗(yàn)以此細(xì)胞量為標(biāo)準(zhǔn)。微移植模型鑒定:微移植后供體成分可在回輸供體細(xì)胞后2周之內(nèi)檢測(cè)到，是以微嵌合形式存在。通過(guò)與單純化療組小鼠比較，微移植組小鼠在臨床表現(xiàn)及病理方面均未發(fā)現(xiàn)明顯GVHD證據(jù)。微移植促造血作用、抗白血病效應(yīng)同時(shí)避

10、免GVHD觀察及機(jī)制初步研究:微移植組早期死亡率明顯降低，白細(xì)胞恢復(fù)情況較化療組有優(yōu)勢(shì)，發(fā)病時(shí)間較化療組延遲2周左右。微移植后供體微嵌合在回輸后2周之內(nèi)可檢測(cè)到;細(xì)胞因子檢測(cè)發(fā)現(xiàn)微移植后2周特別是1周之內(nèi)細(xì)胞因子升高最為明顯，其中IL-2、IL-6、TNF、IFN在微移植組和化療對(duì)照組之間差異最明顯。
　　結(jié)論：成功建立了小鼠白血病模型，選取了(M4mg/kg×1d+A200mg/kg×3d)作為微移植化療方案，并選取6×107作

11、為回輸?shù)墓w細(xì)胞量，從供體嵌合和GVHD方面對(duì)微移植模型進(jìn)行了鑒定，成功建立了微移植模型。通過(guò)白血病小鼠微移植模型建立及組織病理學(xué)和細(xì)胞因子等相關(guān)指標(biāo)的檢測(cè)，推測(cè)微移植促造血作用可能與輸注大量異基因造血細(xì)胞對(duì)受者造血組織的保護(hù)作用以及對(duì)白血病細(xì)胞快速清除并促進(jìn)體內(nèi)參與造血的細(xì)胞因子如IL-6等濃度升高有關(guān)，微移植發(fā)揮抗白血病效應(yīng)可能與供體微嵌合狀態(tài)、微移植后細(xì)胞因子如IL-2、IFN、TNF升高等變化有關(guān)。微移植避免GVHD發(fā)生可能與微