人急性T-淋巴細(xì)胞性白血病小鼠模型建立與鑒定.pdf

1、目的：
　　本實(shí)驗(yàn)利用人急性 T淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞株 Jurkat在重度聯(lián)合免疫缺陷（SCID）小鼠建立急性 T淋巴細(xì)胞系白血病動(dòng)物模型，并從形態(tài)學(xué)、免疫學(xué)等方面進(jìn)行模型的鑒定。然后通過(guò)對(duì)Notch1基因及釵頭轉(zhuǎn)錄因子3（Foxp3）基因的表達(dá)研究，初步探討Notch1/Foxp3與人急性T淋巴細(xì)胞白血病的關(guān)系。
　　研究?jī)?nèi)容和方法：
　　第一部分：SCID小鼠急性T淋巴細(xì)胞白血病模型的建立
　　1. Jurka

2、t細(xì)胞株的培養(yǎng)，瑞氏-吉姆薩、POX、PAS染色觀察細(xì)胞形態(tài)，流式細(xì)胞儀檢測(cè)其免疫表型。
　　2.給予5周齡雌性SCID小鼠對(duì)照組（n=10）環(huán)磷酰胺腹腔注射，按100 mg/kg每只，連續(xù)2天，腹腔注射環(huán)磷酰胺后第一天，經(jīng)尾靜脈注射接種處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Jurkat細(xì)胞，每只小鼠按5×106/只，以0.2ml注射容積注射，連續(xù)注射兩天，注射時(shí)速度宜緩慢；對(duì)照組給予注射相同劑量的生理鹽水。
　　3.觀察各組小鼠移植后行為及狀態(tài)

3、變化。
　　4.定期經(jīng)尾靜脈采血，行外周血白細(xì)胞計(jì)數(shù)檢查，制作外周血涂片，計(jì)數(shù)外周血中淋巴細(xì)胞百分比。
　　5.骨髓涂片染色行瑞氏-吉姆薩染色、POX染色、PAS染色，進(jìn)行有核細(xì)胞分類(lèi)。
　　6.流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)小鼠骨髓中抗人CD3+細(xì)胞比率。
　　7.病理檢查解剖瀕死小鼠或者在移植后第60天處死小鼠后，迅速切取心臟、肝、脾、肺、腎臟、胸骨、腦以4％多聚甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋切片，蘇木精-伊紅染色，光鏡觀察各組織發(fā)

4、生病理學(xué)改變的情況。
　　8.將SCID小鼠器官組織切片準(zhǔn)備好，以抗人-CD3抗體進(jìn)行免疫組化檢測(cè)，以DAB及過(guò)氧化氫進(jìn)行染色。
　　第二部分：Notch1/Foxp3與T-ALL關(guān)系的初步探討
　　1. Trizol法提取各小鼠的全血的總RNA，并逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，采用RT-PCR法檢測(cè)Notch1基因及Foxp3基因的表達(dá)情況。
　　2.采用免疫組化檢測(cè)腫瘤浸潤(rùn)組織中Noth1蛋白及Foxp3蛋白表達(dá)情況。<

5、br>　　結(jié)果：
　　第一部分：
　　1. Jurkat細(xì)胞株離心涂片POX（-）、PAS（+），流式細(xì)胞儀檢測(cè)Jurkat細(xì)胞表達(dá)CD2、CD3、CD5、CD7。
　　2.對(duì)照組小鼠（n=10）隨著時(shí)間體重呈漸進(jìn)增加，模型組小鼠（n=10）移植后在2周后開(kāi)始呈現(xiàn)逐漸下降的趨勢(shì)，體重從發(fā)病前的（13.82±1.63）g下降到（9.75±0.28）g(P<0.05)，并伴有體毛粗糙紊亂，皮膚黏膜蒼白，失明，弓背，步態(tài)不穩(wěn)

6、，活動(dòng)力明顯減低，呈惡病質(zhì)，直至死亡。
　　3.對(duì)照組小鼠（n=10）均無(wú)小鼠死亡，模型組小鼠（n=10）在接種Jurkat細(xì)胞后發(fā)病率為80%(8/10)。生存期平均為（54.1±8.04）天，最短為40天，最長(zhǎng)為60天，中位生存期為57.3天。
　　4.接種Jukkat細(xì)胞后，模型組小鼠（n=10）的白細(xì)胞數(shù)隨著時(shí)間呈漸進(jìn)性增高，最高為（21.26±3.98）×109/L(P<0.05)，外周血涂片中可見(jiàn)原始淋巴細(xì)胞，終

7、末期小鼠外周血中淋巴細(xì)胞比率最高為（31.33±6.21）%，而對(duì)照組淋巴細(xì)胞比率相對(duì)穩(wěn)定，波動(dòng)在（15.20±4.74）%～（21.00±4.07）%。骨髓中有白血病細(xì)胞，成群分布。
　　5.對(duì)照組小鼠骨髓液中未檢測(cè)到人 CD3+淋巴細(xì)胞，而在模型組小鼠的骨髓液中檢測(cè)到人CD3+淋巴細(xì)胞比率為(34.35±4.60)%。
　　6.模型組 SCID小鼠的肝、脾、肺、腎、胃、腸都有腫瘤細(xì)胞浸潤(rùn)，細(xì)胞呈團(tuán)塊狀生長(zhǎng)，包繞器官或者浸

8、潤(rùn)器官內(nèi)部，受浸潤(rùn)組織結(jié)構(gòu)破壞，而心肌、腦等組織未發(fā)現(xiàn)明顯腫瘤細(xì)胞浸潤(rùn)。
　　第二部分：
　　1.通過(guò)RT-PCR方法檢測(cè)，模型組小鼠外周血中有Notch1基因表達(dá)，對(duì)照組則未檢測(cè)到表達(dá)。Foxp3基因的相對(duì)表達(dá)量在對(duì)照組為（0.093±0.004），在模型組為（0.4083±0.0115），進(jìn)行兩個(gè)獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，P<0.05，模型組外周血中Foxp3基因表達(dá)量明顯高于對(duì)照組表達(dá)。
　　2.免疫組織化學(xué)檢測(cè)受累器官組

9、織中Notch1、Foxp3蛋白表達(dá)，采用Image-pro plus專(zhuān)業(yè)圖像分析軟件測(cè)圖片的平均IOD值，從而對(duì)蛋白的表達(dá)進(jìn)行半定量分析，結(jié)果示：模型組中Notch1蛋白的表達(dá)與Foxp3蛋白的表達(dá)與對(duì)照組相比，P<0.05，說(shuō)明模型組中Notch1蛋白、Foxp3蛋白的表達(dá)于對(duì)照組中的表達(dá)的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且均高于對(duì)照組的表達(dá)。
　　結(jié)論：
　　1．采用SCID小鼠在給予環(huán)磷酰胺預(yù)處理成功建立了急性T淋巴細(xì)胞系白血病