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文檔簡介
1、背景:臨床上因骨腫瘤、骨關節(jié)結核需手術廣泛切除,高能量創(chuàng)傷、化膿性骨關節(jié)炎等因素所致的大段骨缺損十分常見,以間充質干細胞(MSC)為種子細胞構建的組織工程骨被公認為修復大節(jié)段骨缺損最有希望的策略之一。組織工程骨修復骨缺損的大量實驗研究著重放在最終的成骨效果和推進臨床前研究,而對于組織工程骨構成要素之一的種子細胞的作用機制研究鮮有涉及,既往有些研究者推測,種子細胞MSCs在體內主要是通過直接分化成骨來彌補宿主成骨能力的不足,從而促進骨缺損
2、的修復,而在我們前期的研究中將骨組織工程的種子細胞MSCs通過綠色熒光標記后進行體內示蹤,發(fā)現移植的MSCs雖可以參與成骨,但是在新生骨組織中大量的是宿主來源的成骨相關細胞,這提示有大量的宿主細胞遷移到組織工程骨移植部位參與成骨,因此我們提出種子細胞可能的修復機制:組織工程骨被移植到骨缺損部位后,局部創(chuàng)傷產生了炎癥,而釋放的炎癥因子刺激了種子細胞與宿主早期炎癥浸潤的單核細胞,它們產生了趨化因子和細胞因子,驅使宿主的成骨相關細胞募集遷移而
3、來。動物模型是骨組織工程研究必要的載體,縱觀目前用于組織工程骨研究的各種動物模型,雖各有其優(yōu)勢但并不適合用于組織工程骨成骨機制的相關研究。
目的:(1)制備簡便易行的小鼠股骨干骨缺損模型,可用于骨組織工程機理研究;(2)MSCs作為種子細胞體外復合DBM材料構建組織工程骨,觀察細胞在材料上的增殖、分化情況;(3)將構建好的組織工程骨移植到小鼠骨缺損模型上,觀察種子細胞的遷移和轉歸情況,驗證模型的科學性和可行性。
4、 方法:(1)MicroCT測量分析小鼠股骨的解剖參數。將30只2~3月齡FVB/N品系的小鼠分成3組,每組10只,用我們自行設計的內固定物固定后分別制備長度為1mm、2 mm和2.5 mm的股骨干中段骨和骨膜缺損模型,術后不同時相點通過影像學和組織學的方法來觀察骨缺損的愈合進程。(2)采用全骨髓細胞貼壁法分離培養(yǎng)小鼠骨髓間充質干細胞,通過細胞表面的特異抗原標志物和多向分化潛能來鑒定。(3)根據本實驗室成熟的構建方法,將綠色熒光小鼠的
5、骨髓間充質干細胞(mBMSCs)作為種子細胞同豬DBM構建組織工程骨,掃描電鏡和激光共聚焦觀察細胞在DBM材料上的增殖、分化情況。(4)將普通型小鼠骨髓間充質干細胞復合DBM材料構建的組織工程骨移植到綠色熒光小鼠雙側股骨干骨缺損模型上,兩側分別植入TEB和單純DBM材料進行對照,利用小動物活體成像系統(tǒng)分別于術后第3天,7天,10天進行觀察,觀察后將兩側標本塊上的細胞消化下來行流式細胞儀分選和計數,對比兩組之間的差異,評價種子細胞是否募集
6、了更多的宿主細胞參與局部骨缺損的修復,進一步驗證模型的有效性。
結果:(1)通過測量得到小鼠股骨的解剖參數:股骨長度(15.48±0.73)mm;股骨干中部橫徑(1.38±0.20)mm;矢狀徑(2.05±0.05)mm;髓腔直徑(0.75±0.80)mm,除去股骨髁和小轉子以上的部分,股骨干長度為8.5mm。建模術后第7、28、56、84天分別對實驗小鼠進行鉬靶X線拍攝觀察,可見骨缺損長度為1mm的實驗組:骨缺損術后第7
7、d內固定位置良好,骨缺損兩斷端對位對線良好,缺損端清晰銳利;骨缺損術后第28d內固定物固定牢靠無移位,骨缺損端有纖維骨痂形成;第56d骨缺損處可見形成大量的骨痂,骨痂密度高;骨缺損術后第84d骨缺損處已有連續(xù)性骨痂通過,達到臨床愈合。骨缺損長度為2mm的實驗組:術后第28d內固定位置好,骨缺損端折線變得模糊;術后第84d骨缺損斷端變得圓鈍,骨痂生長不明顯。缺損長度為2.5mm的實驗組:骨缺損術后連續(xù)觀察,內固定位置良好,骨斷端無成角、短
8、縮移位。術后84d,缺損處無明顯骨痂生長,斷端折線顯示較為銳利,可見類似軟組織影充填。組織學觀察術后84d,HE染色結果顯示,骨缺損長度為1 mm的實驗組缺損處可見大量的新生骨小梁組織填充,髓腔再通;骨缺損長度為2 mm的實驗組可見在一側的缺損骨端有少量成骨,缺損處纖維組織充填,纖維組織與骨端的邊界清楚;骨缺損長度為2.5mm的實驗組可見缺損處充填著大量的纖維結締組織,無骨組織生成。(2)采用全骨髓細胞貼壁法分離的小鼠骨髓間充質干細胞,
9、鏡下可見貼壁生長,呈典型的成纖維細胞形態(tài),流式細胞儀檢測所培養(yǎng)第二代小鼠MSCs的細胞表型:MSCs特異性抗原CD105高表達(92.7%);造血系抗原CD34和CD45低表達;內皮細胞系抗原CD31低表達;病理特殊染色證實細胞具有向成骨、成脂分化的能力。(3)FVB/N品系的小鼠的骨髓間充質干細胞,將其同豬DBM材料體外構建TEB,通過激光共聚焦成像技術和掃描電鏡技術觀察到細胞種植到DBM材料上以后,隨著時間的推移,細胞增殖分化良好,
10、能夠在材料的表面和孔隙內緊密貼附并伸出突觸,熒光強度逐漸增強,細胞呈成纖維細胞形態(tài)。(4)構建雙側小鼠股骨缺損模型,無一例失敗,術后3d的股骨標本大體觀無明顯差異,熒光成像觀察TEB組和DBM組股骨缺損處幾乎看不到綠色熒光;術后7d觀察股骨缺損處材料塊上兩組都有大量的細胞基質,熒光成像可見TEB組和DBM組股骨缺損處局部可見明顯的綠色熒光表達,TEB組較DBM組熒光表達稍強。術后10d股骨標本大體觀察兩組均可見缺損處材料上可見有纖維肉芽
11、組織覆蓋,熒光成像顯示兩組股骨缺損處局部均具有顯著的熒光表達,TEB組與DBM組對比熒光明顯較強烈,表明移植術后10d,TEB組較單純DBM組骨缺損處有更多宿主來源的綠色熒光細胞。小動物成像觀察結束后立即將材料塊上的細胞消化下來進行流式細胞分選和計數,表明術后7天和10天,TEB實驗組相比單純DBM組,表達綠色熒光的細胞量顯著較多。
結論:(1)構建的小鼠股骨干骨缺損模型在不填充任何材料的情況下,Imm的實驗組能過通過自身
12、修復愈合,而2mm以上的實驗性骨缺損在術后3個月牢靠固定的情況下仍不能自行愈合,符合臨界骨缺損的標準,能夠滿足我們后續(xù)的實驗需求。(2)采用全骨髓細胞貼壁的方法分離培養(yǎng)的小鼠骨髓間充質干細胞具有良好的增殖分化潛能,通過表面標記物以及多向分化潛能鑒定證實是實驗所需的骨髓間充質干細胞,(3)DBM材料具有天然的三維網孔骨結構,大孔隙內部雖有大量小孔隙相互連通,但孔徑仍相對較大,掃描電鏡圖像測量DBM的孔隙率約為76%,DBM材料具有良好的細
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