組織工程人工骨成骨活性因子(BMP9,OPG)相關(guān)研究.pdf

1、骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)是作為成骨因子最初在骨基質(zhì)中發(fā)現(xiàn)的，BMPs是轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(TGF-β)超家族的成員之一，目前已經(jīng)分離和鑒定的有20余種。BMP主要的生物學(xué)作用是誘導(dǎo)成骨潛能細(xì)胞，如結(jié)締組織中的間質(zhì)細(xì)胞、骨髓基質(zhì)細(xì)胞、滑膜細(xì)胞和成纖維細(xì)胞等在骨骼或骨骼外轉(zhuǎn)化形成軟骨和骨組織。除了促進(jìn)成骨分化的作用以外，BMPs在很多組織和器官的發(fā)育中也發(fā)揮著重要的作用，比如：心，肺，腎，眼睛，生殖組織，神經(jīng)系統(tǒng)，胎盤(pán)和胎盤(pán)連接，血管和血管生成

2、，脂肪組織的形成。
　　 目前發(fā)現(xiàn)的具有誘導(dǎo)成骨分化能力的BMP主要有BMP2、4、6、7、9，其中rhBMP2和rhBMP7純蛋白已經(jīng)在國(guó)外臨床上用于骨折延遲愈合、骨折不愈合、骨折骨不連、骨缺損、脊柱融合術(shù)的治療，而且取得了一定的治療效果。C2C12、C3H10細(xì)胞以及裸鼠皮下注射的體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)對(duì)AdBMP2、4、6、7、9進(jìn)行研究，結(jié)果提示BMP9誘導(dǎo)成骨能力遠(yuǎn)遠(yuǎn)強(qiáng)于傳統(tǒng)應(yīng)用的BMP2和BMP7。
　　 以往的研究

3、已經(jīng)在細(xì)胞和小動(dòng)物水平證實(shí)了BMP9的成骨能力，但是BMP9在更接近于人類(lèi)的大動(dòng)物體內(nèi)研究尚未有報(bào)道。進(jìn)一步對(duì)BMP9和BMP2、BMP4、BMP6、BMP7之間的協(xié)同作用進(jìn)行研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)BMP之間存在協(xié)同作用，其中BMP9和BMP2的協(xié)同作用最強(qiáng)。單獨(dú)BMP9以及BMP9和其它BMP的協(xié)同運(yùn)用為組織工程人工骨成骨活性因子提供了一個(gè)新的選擇。但是由于BMP9相關(guān)的大動(dòng)物水平的研究相當(dāng)缺乏，在大動(dòng)物水平，特別是負(fù)重骨骨缺損模型上研究BM

4、P9自身的成骨能力、BMP之間的協(xié)同作用已經(jīng)十分必要。為了更好地研究BMP之間的協(xié)同作用，如何避免因?yàn)榛虮磉_(dá)相互干擾和腺病毒滴度測(cè)定中的誤差對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性造成影響，使各種BMP的表達(dá)達(dá)到1∶1的水平也是急需解決的問(wèn)題。
　　 骨保護(hù)素(OPG)也稱(chēng)為破骨細(xì)胞生成抑制因子，是一種分泌型糖蛋白，由401個(gè)氨基酸組成。OPG主要通過(guò)調(diào)節(jié)RANKL/RANK/OPG系統(tǒng)，促進(jìn)新骨的生成，抑制骨的吸收，從而達(dá)到促進(jìn)成骨的作用。RAN

5、KL是骨保護(hù)素的同源配基，主要表達(dá)于成骨細(xì)胞和骨髓基質(zhì)細(xì)胞的表面，RANK主要表達(dá)于破骨細(xì)胞或其前體表面。RANKL與RANK結(jié)合后可以促進(jìn)破骨細(xì)胞的活化、成熟，從而促進(jìn)骨吸收。OPG是RANKL的誘餌受體，與RANK競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合RANKL，OPG與RANKL的結(jié)合減少了RANKL與RANK的結(jié)合，從而抑制破骨細(xì)胞分化、成熟，減少骨吸收。另外OPG能夠通過(guò)誘導(dǎo)堿性磷酸酶和鈣化結(jié)節(jié)形成促進(jìn)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化，可視為一種良好的骨誘

6、導(dǎo)活性因子。
　　 骨活素膠囊系在護(hù)骨膠囊的基礎(chǔ)上改良而得，是純中藥提取的，其主要成分淫羊藿苷可通過(guò)促進(jìn)成骨細(xì)胞分泌骨保護(hù)素，調(diào)節(jié)RANKL/RANK/OPG的動(dòng)態(tài)平衡機(jī)制，從而有效地減少骨吸收，間接地促進(jìn)了骨生成。由于骨活素膠囊是純中藥提取，毒副作用小，可以有效地治療骨質(zhì)疏松癥，而且骨活素膠囊促進(jìn)了OPG的分泌，OPG又可以通過(guò)調(diào)節(jié)骨代謝和骨誘導(dǎo)促進(jìn)骨再生，所以骨活素膠囊為骨折、骨缺損伴有骨質(zhì)疏松癥的病人提供了一個(gè)很好的選擇。

7、但是目前尚未有這方面的研究報(bào)道。在對(duì)骨質(zhì)疏松性骨折進(jìn)行治療時(shí)離不開(kāi)手術(shù)對(duì)骨折部位的復(fù)位和固定，利用合理的手術(shù)方式既能對(duì)骨折進(jìn)行良好的復(fù)位和固定，又能最大程度上對(duì)骨折部位及周?chē)M(jìn)行保護(hù)，將有利于骨質(zhì)疏松性骨折的愈合。
　　 目的：
　　 1、觀察BMP9介導(dǎo)的人工骨在大動(dòng)物負(fù)重骨骨缺損模型(山羊股骨中段臨界骨缺損模型)中的促進(jìn)成骨能力。
　　 2、構(gòu)建雙表達(dá)BMP2、9腺病毒載體，使BMP2和BMP9達(dá)到精確的1∶

8、1表達(dá)，進(jìn)一步驗(yàn)證和研究BMP2和BMP9的協(xié)同效應(yīng)。
　　 3、觀察骨活素膠囊在骨質(zhì)疏松性骨折模型(兔橈骨骨質(zhì)疏松性骨折模型)中的成骨情況，探討OPG用于人工骨組成部分的可能性。
　　 4、介紹一種新型的微創(chuàng)手術(shù)方式治療骨質(zhì)疏松性骨折，為人工骨治療骨折疏松提供良好的復(fù)位和固定。
　　 第一部分：
　　 方法：12只12-18月齡中國(guó)青山羊，股骨中段建立臨界骨缺損模型，隨機(jī)分為兩組，缺損區(qū)域明膠海綿填充，

9、實(shí)驗(yàn)組加入預(yù)先準(zhǔn)備好的BMP9腺病毒感染的骨髓基質(zhì)細(xì)胞懸液，對(duì)照組加入GFP腺病毒感染的骨髓基質(zhì)細(xì)胞懸液，術(shù)后1天、2周、4周、8周、12周、20周行X片檢查，20周時(shí)進(jìn)行CT檢查，處死動(dòng)物，行大體標(biāo)本、組織學(xué)染色和生物力學(xué)的檢測(cè)。
　　 結(jié)果：X片顯示實(shí)驗(yàn)組較對(duì)照組骨痂形成更早更多，大體標(biāo)本、組織學(xué)染色顯示實(shí)驗(yàn)組的新生骨更加成熟，CT顯示實(shí)驗(yàn)組新生骨塑形更好，生物力學(xué)檢測(cè)顯示實(shí)驗(yàn)組新生骨痂的力學(xué)強(qiáng)度更強(qiáng)。
　　 結(jié)論：

10、BMP9介導(dǎo)的組織工程人工骨可以有效地促進(jìn)山羊股骨骨缺損的愈合。同時(shí)實(shí)驗(yàn)結(jié)果也發(fā)現(xiàn)BMP9在體內(nèi)能夠促進(jìn)脂肪的分化。治療五個(gè)月后BMP9人工骨治療組與正常骨在形態(tài)和生物力學(xué)特性上仍有差距，如何避免脂肪分化，尋找更強(qiáng)的成骨活性因子組合有待進(jìn)一步研究。
　　 第二部分：
　　 方法：自單一表達(dá)BMP2或BMP9 AdEasy質(zhì)粒上擴(kuò)增BMP2和BMP9片段，先后亞克隆至穿梭質(zhì)粒pASG2，獲得雙表達(dá)穿梭質(zhì)粒pASG2-BMP

11、2、9，酶切及PCR鑒定確認(rèn)、測(cè)序正確后同源重組獲得雙表達(dá)BMP2、BMP9腺病毒質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染至HEK-293細(xì)胞中包裝和擴(kuò)增得到高滴度雙表達(dá)BMP2、BMP9腺病毒，體外感染C3H10細(xì)胞RT-PCR鑒定其表達(dá)并觀察其早期誘導(dǎo)成骨情況。
　　 結(jié)果：成功構(gòu)建雙表達(dá)BMP2、BMP9的腺病毒，滴度約為1010IU/ml，RT-PCR證實(shí)此腺病毒在C3H10細(xì)胞中表達(dá)，觀察到綠色熒光，其感染C3H10細(xì)胞的早期堿性磷酸酶含量較感染單

12、一表達(dá)BMP2或BMP9腺病毒的C3H10細(xì)胞增加。
　　 結(jié)論：成功構(gòu)建雙表達(dá)BMP2、9的重組腺病毒載體，初步驗(yàn)證了BMP2、9能夠早期協(xié)同成骨，為進(jìn)一步研究BMP2和BMP9的協(xié)同成骨作用和制備高效的組織工程人工骨提供了有利的工具。
　　 第三部分：
　　 方法：40只8-12月齡雌性新西蘭大耳兔，卵巢去勢(shì)法10周得到I型骨質(zhì)疏松模型，再行橈骨骨折造模，從而建立骨質(zhì)疏松性骨折模型。模型建立后隨機(jī)分為2組，實(shí)

13、驗(yàn)組和對(duì)照組分別給予含1g/kg·d骨活素膠囊的生理鹽水和淀粉糊5ml灌胃，在2、4、8周隨機(jī)選取動(dòng)物行影像學(xué)、血液生化指標(biāo)、HE染色、pcna免疫組化和生物力學(xué)檢測(cè)。
　　 結(jié)果：骨活素干預(yù)的實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物較對(duì)照組骨痂、骨小梁形成增多增快，骨痂力學(xué)強(qiáng)度增強(qiáng)。
　　 結(jié)論：骨活素膠囊能使骨質(zhì)疏松性骨折的愈合時(shí)間縮短，強(qiáng)度增強(qiáng)。
　　 第四部分：介紹一種微創(chuàng)外科手術(shù)方式(椎體后凸成形術(shù))，為骨質(zhì)疏松性骨折人工骨替代治療

14、提供新的選擇。
　　 方法：2006年3月-2007年8月，收治60例骨質(zhì)疏松性脊柱骨折患者。其中40例選擇椎體后凸成形術(shù)治療(試驗(yàn)組)，20例選擇保守治療(對(duì)照組)。試驗(yàn)組：男6例，女34例；年齡56～78歲，平均68.7歲。病程10～18個(gè)月，平均12個(gè)月。骨折涉及73個(gè)椎體。對(duì)照組：男5例，女15例；年齡57～80歲，平均70.1歲。病程9～16個(gè)月，平均13個(gè)月。骨折涉及41個(gè)椎體。兩組患者性別、年齡、病程、疼痛視覺(jué)模擬

15、評(píng)分(VAS)、歐洲脊柱骨質(zhì)疏松癥研究(EVOS)問(wèn)卷評(píng)分，以及傷椎前中柱椎體高度、后凸Cobb角比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。
　　 結(jié)果：試驗(yàn)組患者術(shù)后切口均I期愈合，無(wú)骨水泥滲漏。兩組患者均獲隨訪，隨訪時(shí)間36～38個(gè)月。試驗(yàn)組治療后1～3 d及12、36個(gè)月VAS評(píng)分、EVOS評(píng)分、傷椎前中柱椎體高度及后凸Cobb角均較術(shù)前明顯改善(P<0.05)；對(duì)照組治療后以上指標(biāo)與術(shù)前比較無(wú)改善(P>0.0

16、5)。治療后12、36個(gè)月，試驗(yàn)組以上指標(biāo)均優(yōu)于對(duì)照組(P<0.05)。治療后36個(gè)月，對(duì)照組患者新發(fā)脊柱骨折發(fā)生率高于試驗(yàn)組(x2=16.347，P=0.015)。
　　 結(jié)論：椎體后凸成形術(shù)治療骨質(zhì)疏松性脊柱骨折后，疼痛癥狀可明顯緩解，活動(dòng)功能恢復(fù)，且新發(fā)脊柱骨折發(fā)生率較保守治療低。
　　 綜上所述，BMP9的誘導(dǎo)成骨能力在大動(dòng)物骨缺損模型中得到證實(shí)，BMP2和BMP9具有協(xié)同效應(yīng)，OPG能夠促進(jìn)OPF的愈合，PKP