富含功能蛋白的凍干組織工程骨的構(gòu)建及成骨效果與成骨機制的研究.pdf

1、研究背景及目的:目前臨床對骨修復(fù)材料有著巨大需求,并且日益增長,但是現(xiàn)在的研究進入了瓶頸期。在組織工程骨的三要素中均存在很多問題導(dǎo)致研究停滯不前,將構(gòu)建好組織工程骨植入體內(nèi)首先面對的是其血管化問題,研究發(fā)現(xiàn)組織工程骨植入體內(nèi)后因營養(yǎng)物質(zhì)及氧氣的缺乏,導(dǎo)致種子細胞的大量死亡;而因子的應(yīng)用可以避開血管化問題帶來的困擾,但是面對體內(nèi)復(fù)雜的成骨內(nèi)環(huán)境及成骨因子讓我們無從下手。我們課題組在關(guān)注組織工程骨血管化的問題時,也發(fā)現(xiàn)將組織工程骨植入體內(nèi)后

2、種子細胞大量死亡,但是一個較為奇怪的現(xiàn)象是組織工程骨的成骨效果非常好,甚至接近自體骨的水平,這與許多研究者的結(jié)果一致。給我們的提示是死亡的種子細胞是不是在后來的骨修復(fù)中發(fā)揮著積極的作用?目前的研究發(fā)現(xiàn)MSCs可以被稱為因子庫,因為其分泌大量的細胞因子(生長因子、募集因子、炎性因子等)通過旁分泌或自分泌的方式調(diào)控宿主細胞募集、骨發(fā)生、血管發(fā)生及骨重塑等過程,細胞的裂解液在體外也能刺激細胞的增殖分化。基于以上研究基礎(chǔ),我們設(shè)想體外構(gòu)建的組織

3、工程骨直接凍干將細胞裂解,植入體內(nèi)后利用各類作用不同的細胞因子間協(xié)同作用來促進骨修復(fù)。
　　方法:
　　實驗一:首先我們選取hUC-MSCs作為我們研究的種子細胞,通過橫截面HE染色、免疫熒光染色觀察臍帶結(jié)構(gòu)及MSCs分布區(qū)域,然后有針對性進行分離。為保證快速、有效、規(guī)范、質(zhì)控地分離細胞,我們發(fā)明了專用的組織培養(yǎng)皿和反復(fù)培養(yǎng)法。將組織塊培養(yǎng)皿與普通的培養(yǎng)皿進行對比研究,觀察組織塊的漂浮數(shù),傳代時細胞數(shù)等數(shù)據(jù)。然后將組織塊進行

4、反復(fù)培養(yǎng),收獲T1-P3, T3-P3和T5-P3 hUC-MSCs并通過流式鑒定細胞表面分子,誘導(dǎo)其多向分化等來對反復(fù)培養(yǎng)收獲的細胞進行鑒定。為驗證反復(fù)培養(yǎng)細胞的骨修復(fù)能力,我們設(shè)計了體內(nèi)、體外實驗。體外實驗首先比較細胞的增長動力,及經(jīng)過成骨誘導(dǎo)后RT-PCR檢測ALP, RUNX2和OC基因表達水平及蛋白表達水平。體內(nèi)實驗中我們將T1-P3和T5-P3分別構(gòu)建TEB,然后將其植入到裸鼠的左右側(cè)髂骨表面,觀察異位成骨能力,8周后行Mi

5、cro-CT,HE及Masson染色檢測反復(fù)培養(yǎng)細胞在體內(nèi)的成骨能力。
　　實驗二:構(gòu)建 FD-TEB并進行體內(nèi)驗證,制作 h-DBM,并利用第二章中的方法分離細胞,構(gòu)建TEB并記錄細胞的上架率。通過普通光鏡、掃描電鏡、激光共聚焦、HE染色觀察TEB構(gòu)建情況,證明種子細胞大量存在于DBM上。將構(gòu)建的TEB進行深低溫凍干,通過掃描電鏡觀察定性,測量支架材料上不同時間點蛋白總量以確定最佳體外構(gòu)建時間,Raybiotech蛋白芯片對21

6、種成骨因子及43種募集、炎性細胞因子進行定量,判斷各類、各種細胞因子是否存在DBM上。對FD-TEB進行體外緩釋實驗,觀察體外釋放過程。體內(nèi)對FD-TEB的成骨效果進行驗證,研究利用裸鼠的股骨半原位實驗,將FD-TEB植入裸鼠的左側(cè)股骨旁,TEB植入到右側(cè)股骨旁,在術(shù)后3、6、9周Micro-CT檢測新骨骨量及新骨骨密度,HE及Masson染色觀察新骨的細胞及細胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)。
　　實驗三:在山羊動物模型中驗證 FD-TEB的成骨效

7、果,分離山羊 UC-MSC并進行鑒定,鑒定的方法是流式鑒定表面分子,三系誘導(dǎo)鑒定其多向分化潛能。構(gòu)建山羊-TEB,普通光鏡及掃描電鏡觀察種子細胞情況,然后將其凍干,掃描電鏡判斷構(gòu)建情況。手術(shù)在山羊的股骨造2cm骨及骨膜缺損,將FD-TEB及DBM分別植入到山羊左右側(cè)的股骨缺損處。術(shù)后2、4周行放射性核素顯像,判斷股骨缺損處的血液灌注情況。2、4、8、16周 X線觀察股骨缺損修復(fù)的進展情況,8、16周行 CT檢查,并計算新骨體積及其CT值

8、,比較兩側(cè)的骨修復(fù)情況。同時行HE、Masson染色觀察細胞及細胞外基質(zhì)形態(tài)。術(shù)后檢測白細胞、肝腎功等檢測機體內(nèi)環(huán)境情況。
　　實驗四:凍干-TEB與TEB類似有著體內(nèi)高感染率問題,首先構(gòu)建凍干TEB,具體方法同第四部分,用萬古霉素(濃度為50mg/ml)和藻酸鹽(濃度是16％)的溶液制備藻酸鹽萬古霉素微球,然后放到纖維蛋白原-磷酸二氫鉀的混合溶液中攪拌,最后放入到400IU/ml的凝血酶溶液中,使微球的表面形成一層纖維蛋白凝膠,

9、增加微球的緩釋時間。將 FG-Vanco-AB進行體外緩釋實驗,檢測緩釋萬古霉素濃度。然后構(gòu)建抗菌-FD-TEB,體視顯微鏡進行觀察。
　　結(jié)果:
　　實驗一:組織塊培養(yǎng)皿克服了以前分離過程中組織貼壁不牢固,組織利用率低的缺點,培養(yǎng)12天時,實驗組無組織塊漂浮,而對照組共有13(n=3)塊組織漂浮。細胞游出的組織塊實驗組與對照組是(86±2.7)% VS(44±4)%, n=3; p<0.01,有著明顯的統(tǒng)計學(xué)差異。12天傳

10、代時細胞數(shù)量是:(24.7×104±3.6×104)VS(5.1×104±1.0×104), n=3; p<0.01。經(jīng)鑒定反復(fù)培養(yǎng)的細胞均陽性表達CD44、CD73、CD90、CD105,陰性表達CD34、CD45,能被成功向成骨、成脂、成軟骨方向分化。細胞的體外倍增時間均為32h,細胞生長曲線的調(diào)整期、指數(shù)增長期、平臺期基本類似。經(jīng)體外成骨誘導(dǎo)后ALP, RUNX2和OC基因及蛋白表達水平無明顯統(tǒng)計學(xué)差異。植入體內(nèi)8周后,實驗組及對

11、照組BV/TV分別是(44.2±5.3)% VS(48.5±4.4)%,BMD是(0.41±0.09)g/cm2 VS(0.44±0.08)g/cm2。
　　實驗二:在構(gòu)建TEB的過程中,發(fā)現(xiàn)細胞上架率在(82.4±3.3)%左右,普通光鏡、掃描電鏡、激光共聚焦、HE染色等均發(fā)現(xiàn)細胞與支架材料相容性良好,胞漿舒展呈扁平狀并隨時間進行增殖。在體外的實驗中,細胞增殖在10天左右進入平臺期,裂解的蛋白量為11991ug/ml,凍干后為7

12、544ug/ml,凍干后蛋白保有率為(0.65±0.03)%(n=8)。在10天時,募集因子、生長因子、炎性因子、成骨因子等均有很高的表達。體外緩釋實驗中也發(fā)現(xiàn)總蛋白在21天時檢測還有38ug/cm3。體內(nèi)實驗發(fā)現(xiàn)3周時實驗組基本修復(fù),而對照組未完成修復(fù),6周實驗組的異位BV是0.5±0.13 mm3,骨密度是:0.21±0.07g/cm2,對照組未見異位成骨;9周時,實驗組的異位出現(xiàn)大量的片狀骨化影,而對照組的異位出現(xiàn)較多的骨化影。實

13、驗組的異位 BV是(1.2±0.26)mm3,而對照的是(0.4±0.18)mm3,骨密度分別是:(0.35±0.11)g/cm2 VS(0.27±0.11)g/cm2。
　　實驗三:經(jīng)過鑒定分離的細胞為山羊MSCs,可以分化成骨、脂肪、軟骨。光鏡及掃描電鏡觀察TEB及 FD-TEB同第三部分實驗,細胞及細胞外基質(zhì)大量的存在于支架材料上,證明 FD-TEB構(gòu)建成功。將其植入到體內(nèi)后,術(shù)后2周血池相左右側(cè)分別為(410±74.5)V

14、S(373±45.8),骨掃描相為(513±62.9)VS(381±64.3),術(shù)后4周左右側(cè)的血池相為(559±98.1)VS(378±84.6),骨掃描相為(1349±103.1)VS(870±90.7),左右側(cè)間比較均有著明顯的統(tǒng)計學(xué)差異。術(shù)后8周左右側(cè)新骨體積為(1518±159.8)VS(1039±178.2)(mm3),CT值為(620±68.8)VS(400±86);術(shù)后16周左右新骨體積為(2532±189.3)VS(2

15、421±111.7)(mm3),CT值為(813±104.8 VS(785±118.2),左右側(cè)均有統(tǒng)計學(xué)差異。術(shù)后白細胞、谷草轉(zhuǎn)氨酶、肌酐、白蛋白均無有意義的變化。
　　實驗四:掃描電鏡證實FD-TEB構(gòu)建成功,觀察到的情況與之前的類似,凍干后的TEB上見大量隆起的蛋白及細胞外基質(zhì)。根據(jù)優(yōu)化的方案制作的 FG-Vanco-AB在體外緩釋實驗中萬古霉素濃度大于殺菌濃度敏感折點(5mg/ml)的時間為24天。將微球與凍干-TEB附合

16、,可以放入-80℃冰箱中長期保存直到應(yīng)用。
　　結(jié)論:研究總結(jié)了一套完整、高效的臍帶Wharton’s jelly-MSCs細胞的分離方法,并且通過貼壁培養(yǎng)及反復(fù)培養(yǎng)可以最大限度的利用臍帶組織。反復(fù)培養(yǎng)的細胞經(jīng)鑒定不但是hUC-MSCs,而且體外、體內(nèi)在成骨能力方面無明顯差異。成功構(gòu)建凍干-TEB,體外實驗中證實有大量的細胞因子存在于支架材料表面,在裸鼠、山羊的體內(nèi)進行成骨方面的檢測,證實其成骨效果明顯優(yōu)于單純的 DBM,說明了凍