成骨和成血管因子聯(lián)合應(yīng)用修復(fù)骨缺損的研究.pdf

1、背景：組織工程化骨在大段骨缺損修復(fù)中的應(yīng)用日益廣泛，但是保持其回植后細胞的營養(yǎng)以及盡快建立血供卻逐漸成為影響其療效的瓶頸之一。骨形態(tài)發(fā)生蛋白—2(BMP-2)的成骨作用早已獲得公認，內(nèi)皮細胞生長因子(VEGF)可以促進血管形成進而促進血管化，但是其誘導(dǎo)形成的新生血管欠成熟，結(jié)構(gòu)較差，而血管生成素-1(Ang-1)可以促進新生血管的成熟。 目的：通過引入促進血管化的生長因子加速組織工程骨植入體內(nèi)后的血管化和整合過程，從而改善其修復(fù)

2、骨缺損的效果。 材料和方法：應(yīng)用磷酸鈣共沉淀法制備Ad.VEGF重組腺病毒，將鑒定好的病毒克隆進一步擴增、純化和測定滴度。用各種病毒載體轉(zhuǎn)染兔骨髓間基質(zhì)干細胞(rBMSC)鑒定病毒載體功能，同時摸索合理的轉(zhuǎn)染滴度。然后以不同載體和不同滴度的配比轉(zhuǎn)染BMSC，觀察細胞在不同轉(zhuǎn)染和培養(yǎng)方式下的增值和分化，以選擇合理的轉(zhuǎn)染方式和培養(yǎng)方式。以轉(zhuǎn)染Ad-BMP-2和Ad-Bic的rBMSC或未轉(zhuǎn)染的BMSC復(fù)合到β-TCP材料上，以確定確

3、定合理的接種密度和體外培養(yǎng)時間。用不同組合基因修飾的rBMSCs構(gòu)建組織工程復(fù)合體，觀察其在裸鼠體內(nèi)成血管和成骨過程。用不同組合基因修飾的rBMSCs構(gòu)建組織工程復(fù)合體，植于家兔前臂骨缺損中，觀察其影像學(xué)、組織學(xué)及力學(xué)變化。 結(jié)果：構(gòu)建的復(fù)制缺陷重組腺病毒Ad-VEGF轉(zhuǎn)染效率高、毒性低，體外使用安全。各病毒載體在rBMSCs內(nèi)均可穩(wěn)定轉(zhuǎn)染和表達，在同時引入多個基因的情況下，分別用各載體轉(zhuǎn)染之后共培養(yǎng)，其效果優(yōu)于多載體共轉(zhuǎn)染，并

4、且Ad-BMP-2轉(zhuǎn)染的細胞與Ad-VEGF或Ad-Bic轉(zhuǎn)染的細胞比例為4：1左右最為適宜。細胞接種到支架材料后可在材料內(nèi)黏附并增殖，當(dāng)細胞接種時的濃度為2×107/ml時的黏附率較為理想，超過此濃度則表現(xiàn)為過飽和。另外根據(jù)細胞增殖的觀察，體外培養(yǎng)在7天到天以后細胞增殖漸轉(zhuǎn)為平臺增長期。裸鼠實驗中，聯(lián)合應(yīng)用Ad-BMP-2與Ad-VEGF/Ang-1(Ad-Bic)組、聯(lián)合應(yīng)用Ad-BMP-2與Ad-VEGF組和單用Ad-BMP-2組

5、有異位骨形成，其他各組均無成骨。聯(lián)合應(yīng)用Ad-BMP-2與Ad-VEGF/Ang-1(Ad-Bic)組成骨和成血管優(yōu)于聯(lián)合應(yīng)用Ad-BMP-2與Ad-VEGF組，后者又優(yōu)于單用Ad-BMP-2組。兔體內(nèi)大段骨缺損中，對各組不同時間點的影像學(xué)表現(xiàn)進行分析亦提示聯(lián)用組可獲得更好和更快的骨修復(fù)，缺損部位的脫鈣切片HE染色亦支持此結(jié)果。所有實驗中均未見腫瘤形成。 結(jié)論：兩種病毒載體應(yīng)用時，以分別轉(zhuǎn)染后共培養(yǎng)效果較好，當(dāng)同時引入Ad-BM

6、P-2和Ad-VEGF或Ad-Bic時，二者比例以4：1左右為適；不論轉(zhuǎn)染與否，細胞均可在β-TCP表面黏附并增殖，且不影響其功能。接種應(yīng)以體外培養(yǎng)第七天或第八天是操作較為適宜，接種時細胞濃度2×107/ml左右為宜；聯(lián)合應(yīng)用BMP-2，VEGF和血管生成素-1可以產(chǎn)生有效的協(xié)同作用，從而顯著改善細胞支架材料在裸鼠體內(nèi)的血管化和成骨過程，其效果優(yōu)于任何單用甚至二者聯(lián)用的效果。聯(lián)合應(yīng)用BMP-2，VEGF和血管生成素1對自體BMSC進行基