納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體載辛伐他汀體內(nèi)外成骨性能及成骨機(jī)制的研究.pdf

1、全球每年與骨組織再生相關(guān)的手術(shù)多達(dá)130余萬，治療方案從自體骨移植、同種異體骨移植、異種骨組織移植、新型骨替代材料移植、引導(dǎo)骨再生到骨組織工程技術(shù)等都有大量的研究和報(bào)道。盡管這些方法已經(jīng)取得了巨大的進(jìn)展，但仍存在各種各樣的問題，如:技術(shù)復(fù)雜、費(fèi)用高、周期長、生物安全性不足等，骨組織工程技術(shù)還存在支架材料強(qiáng)度差、種子細(xì)胞來源受限、外源性生長因子價(jià)格昂貴等。
　　辛伐他汀(simvastatin，SV)是一種無活性的小分子內(nèi)酯類藥物，

2、它是羥甲基戊二酰輔酶A(HMG-COA)還原酶抑制劑，臨床上常用的一類降高血脂、降膽固醇類藥物，進(jìn)入人體后經(jīng)由肝臟細(xì)胞內(nèi)活性酶轉(zhuǎn)化成可抑制甲羥戊酸合成功能的活性體。自1999年Mundy等首次從3000多種臨床藥物中篩選出他汀類藥物（SV和洛伐他?。┛纱龠M(jìn)體內(nèi)外成骨細(xì)胞中BMP-2基因的表達(dá)，越來越多的焦點(diǎn)集中在SV成骨性能的研究，并證明SV有較好的促成骨作用，包括可以促使BMSCs向骨缺損部位的遷移，促進(jìn)成骨細(xì)胞的分化以及促進(jìn)血管生成

3、，同時(shí)還可以抑制破骨細(xì)胞的作用。
　　藥物緩釋系統(tǒng)是將納米新型技術(shù)與臨床藥物優(yōu)化結(jié)合的一種體現(xiàn)形式。良好的藥物緩釋系統(tǒng)可以在起到治療作用的同時(shí)降低藥物可能的毒副作用，實(shí)現(xiàn)藥物緩釋和靶向性，并避免藥物的過早擴(kuò)散和清除。納米技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于提高難溶性藥物（如紫杉醇等抗腫瘤性藥物）生物利用度領(lǐng)域中，采用的制劑形式多樣并取得了顯著成果，如聚合物納米粒、納米混懸劑、脂質(zhì)體、微乳、脂質(zhì)納米粒、膠束等。其中以天然或合成的類脂為原料的脂質(zhì)類納米

4、載體可以有效增加難溶性藥物的溶解度，尤其適用于生物藥劑學(xué)分類系統(tǒng)(BCS)中Ⅱ類（低溶解度，高滲透性）和Ⅳ類藥物（低溶解度，低滲透性）的遞送;可以有效增加藥物的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)能力;進(jìn)入體內(nèi)可被巨噬細(xì)胞作為外界異物吞噬，具有較強(qiáng)的被動靶向性并選擇性的集中于網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)，特異性地靶向肝脾組織;同時(shí)納米載體可以延長藥物在血液中滯留時(shí)間，起到一定的緩釋藥物儲庫作用;且類脂材料無毒、無免疫原性、易被機(jī)體吸收，同時(shí)避免使用毒性較大的表面活性劑和有機(jī)溶劑;

5、給藥途徑多樣化，易于多功能表面修飾，且有良好的市場前景等。第二代脂質(zhì)納米粒-納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體(nanostructured liquid carriers，NLC)是采用液態(tài)脂質(zhì)（如油酸、蓖麻油、中鏈脂肪酸甘油酯等）和固體脂質(zhì)混合作為脂質(zhì)材料而制成的納米粒，由于液體脂質(zhì)的參與，可以顯著提高藥物的載藥量，并打亂了固體脂質(zhì)原本的有序結(jié)構(gòu)，使脂質(zhì)結(jié)構(gòu)更加穩(wěn)定，不易發(fā)生晶型轉(zhuǎn)變而結(jié)晶，從而提高了藥物的載藥率和穩(wěn)定性。有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載

6、體載辛伐他汀(nanostructured lipid carriers containing simvastatins，SNs)相比單純的SV混懸液有延遲藥物緩慢釋放的作用。也有研究表明SNs較單純的SV生物利用度提高了2.55倍，在大鼠腸道的吸收明顯高于游離SV。但前研究者所采用的制備納米脂質(zhì)體的溶劑注射法和超聲乳化法均會引入部分有機(jī)溶劑，并殘留于最終產(chǎn)品中，且目前尚未見納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體載SV用于骨再生方面的報(bào)道。因此，我們假設(shè)采用

7、微射流法可以很好的實(shí)現(xiàn)NLC對SV的包裹，且相比同等含量的單純SV藥物有較好的體外釋放能力，同時(shí)，納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體載SV較單純SV藥物有更好的促成骨作用。
　　本實(shí)驗(yàn)擬采用較新的微射流技術(shù)(Microfluidization)制備SNs，避免有機(jī)溶劑的使用且操作簡單;擬用MG-63成骨細(xì)胞為模型，來驗(yàn)證SNs的促成骨性能，并探討相關(guān)促成骨機(jī)制;并擬通過建立兔顱骨標(biāo)準(zhǔn)骨缺損，來進(jìn)一步驗(yàn)證SNs的促成骨性能和相關(guān)成骨機(jī)制。以期尋找更好

8、的藥物緩釋系統(tǒng)，提高SV的生物利用度，促進(jìn)SV的成骨效應(yīng)，為臨床骨組織再生提供更好的解決方法和理論基礎(chǔ)。
　　目的:
　　1.研究納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體載SV的生物學(xué)特性，嘗試尋找提高SV生物利用度的理想劑型;
　　2.研究納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體載SV較單純的SV藥物是否具有更優(yōu)的體內(nèi)外促成骨能力及其可能機(jī)制。
　　方法:
　　第一部分:納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體載SV的合成、檢測及優(yōu)選
　　1.空白NLC的制備和優(yōu)選

9、r>　　首先，利用微射流機(jī)根據(jù)組成成分比例的不同制備不同組別的NLCs，即:液態(tài)脂質(zhì)(OA)占總脂質(zhì)質(zhì)量的10％、25％和40％，表面活性劑P188占總體積的0、0.2％和0.4％及微射流次數(shù)1、2和4次，分17組制備空白NLCs，檢測粒徑、PI、Zeta電位;并用響應(yīng)面分析法(box beken design，BBD)優(yōu)選最佳NLC的制備條件，其中X變量:OA濃度(X1，wt％，0.10 to0.40)、P188濃度(X2，w/v％，

10、0 to0.40)、微射流的循環(huán)次數(shù)(X3，次數(shù)，1-4次);Y變量:粒徑(Y1)，PI(Y2) andzeta點(diǎn)位(Y3)。
　　2.根據(jù)BBD優(yōu)選的最佳NLCs制備條件，按照三種不同的理論載藥量(5％、10％和20％)進(jìn)行載藥，并進(jìn)行粒度分析、形貌觀察、載藥量和包封率測量及體外緩釋檢測。其中，馬爾文激光粒度儀檢測粒徑大小、多分散指數(shù)和zeta電位;透射電子顯微鏡檢測形貌;高效液相色譜儀檢測藥物包封率和載藥率;體外緩釋實(shí)驗(yàn)采用透

11、析法。
　　第二部分:納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體載SV體外成骨性能及成骨機(jī)制的研究
　　1.MG-63細(xì)胞的培養(yǎng)
　　取凍存MG-63細(xì)胞株復(fù)蘇，以1×106/ml密度接種于含10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基的25 ml培養(yǎng)瓶中，置于37℃、5％ CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)。24小時(shí)后更換新鮮培養(yǎng)液，除去未貼壁細(xì)胞，以后每48～72小時(shí)換液，逐日觀察、記錄其生長、增殖情況。
　　2.納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體載SV對成骨細(xì)胞增殖和分化功

12、能的影響
　　實(shí)驗(yàn)組分為:SNs組（2.5×10-9to2.5×10-6M）、單純SV組(2.5×10-9 to2.5×10-6M)、空白NLC組和空白對照組。分別檢測SNs對MG-63細(xì)胞的增殖（MTS法），堿性磷酸酶ALP活性，體外礦化能力（茜素紅染色法）以及骨鈣素的蛋白和mRNA表達(dá)的影響。
　　第三部分:納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體載SV體內(nèi)成骨性能及成骨機(jī)制的研究
　　1.動物模型的建立和標(biāo)本制取
　　二十只健康新

13、西蘭大白兔，雄性，5-6個(gè)月齡，由廣東省實(shí)驗(yàn)動物檢測所供。嚴(yán)格按照無菌操作流程進(jìn)行，麻醉后常規(guī)消毒鋪巾，顱頂垂直切口，翻粘骨膜全厚瓣，骨動力系統(tǒng)制備4個(gè)直徑為8mm的環(huán)形顱骨標(biāo)準(zhǔn)骨缺損，下方至硬腦膜。隨機(jī)分為四組:SNs（含0.5 mg SV）混合骨粉組、0.5 mg單純SV混合骨粉組、骨粉組和空白對照組。分別將SNs（含0.5 mg SV）混合骨粉、0.5 mg單純SV混合骨粉和骨粉植入環(huán)形顱骨標(biāo)準(zhǔn)骨缺損內(nèi)，分層縫合。術(shù)后使用3d抗生

14、素。術(shù)后4周處死，處死前13-14 d注射四環(huán)素，3-4 d注射鈣黃綠素。骨動力系統(tǒng)切取完整的顱骨并修整邊緣，備用。
　　2.組織學(xué)分析
　　對骨缺損修復(fù)區(qū)及鄰近骨組織行組織學(xué)、組織形態(tài)學(xué)及免疫組織化學(xué)分析。一半樣品行脫鈣處理，制作石蠟切片，行HE染色、ALP染色、Masson染色和OC免疫組織化學(xué)染色。顯微鏡下拍攝組織學(xué)照片后，利用IPP軟件對新生骨面積百分比進(jìn)行測量。光學(xué)顯微鏡下觀察ALP染色陽性細(xì)胞及OC染色陽性細(xì)胞并

15、計(jì)數(shù)。另一半樣品制作硬組織切片，共聚焦顯微鏡下觀察骨缺損內(nèi)雙熒光標(biāo)記的骨組織再生情況，并用圖像測量軟件進(jìn)行測量;通過甲苯氨藍(lán)染色法進(jìn)一步觀察不同組別間的新骨再生情況。
　　結(jié)果:
　　1.本研究中，采用微射流法成功制備了SNs，采用三因素、三水平星點(diǎn)設(shè)計(jì)分析并優(yōu)化出最佳制備條件為OA濃度為40％（wt％），P188表面活性劑濃度為0.4％(w/v％)，微射流機(jī)循環(huán)次數(shù)為4次。依據(jù)響應(yīng)面分析的最佳制備條件，我們采用微射流法成功

16、制備出了三種理論載藥量條件下的SNs(SV/NLC，wt％)，平均粒徑為174.7nm，包封率高達(dá)94.1％，實(shí)際載藥率可達(dá)18.2。體外緩釋實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明SNs釋放SV較單純的SV有明顯的控釋效果。
　　2.為了驗(yàn)證SNs具有良好的生物學(xué)作用，本課題進(jìn)行了體外細(xì)胞攝取實(shí)驗(yàn)和增殖分化檢測實(shí)驗(yàn)。通過細(xì)胞攝取實(shí)驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)納米載藥進(jìn)入成骨細(xì)胞是通過內(nèi)吞作用完成，細(xì)胞內(nèi)的熒光顆粒在37℃條件下會隨著濃度和時(shí)間的增加而增加。細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果

17、表明，SNs相比單純的SV更能夠有效的促進(jìn)細(xì)胞的增殖，且存在時(shí)間和劑量依賴性，在低濃度條件下會促進(jìn)細(xì)胞增殖，而高濃度條件下存在輕微抑制現(xiàn)象，且高濃度的抑制作用可以通過納米載藥的緩控釋作用來減小。另外，細(xì)胞分化實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，SNs能更好的促進(jìn)堿性磷酸酶活性的表達(dá)、礦化結(jié)節(jié)的形成及相關(guān)成骨蛋白和成骨基因的表達(dá)。其中以含2.5×10-7M和2.5×10-8M SV的SNs組效果最佳。
　　結(jié)論:
　　1.微射流法可成功制備出高包封