Chitosan-PB-MSCs可注射組織工程骨用于骨質(zhì)疏松種植修復(fù)的初步研究.pdf

1、骨質(zhì)疏松是以骨量減少、骨組織顯微結(jié)構(gòu)退化為特征的一種系統(tǒng)性骨代謝疾病，頜骨作為全身骨骼的一部分，與全身其他骨骼一樣會(huì)受到骨質(zhì)疏松的影響，導(dǎo)致頜骨內(nèi)骨組織的數(shù)量和質(zhì)量下降，使種植體植入后愈合時(shí)間延長(zhǎng)，BIC、BD、BA下降，對(duì)種植牙長(zhǎng)期穩(wěn)定的發(fā)揮功能構(gòu)成了威脅；同時(shí)，骨質(zhì)疏松加快了剩余牙槽嵴吸收速度，降低牙槽嵴高度和寬度，使牙槽骨擴(kuò)增術(shù)面臨著更大的失敗風(fēng)險(xiǎn)。鑒于此，骨質(zhì)疏松被認(rèn)為是種植牙治療的相對(duì)危險(xiǎn)癥。針對(duì)骨質(zhì)疏松患者，如何使種植體快速

2、達(dá)到良好的骨整合狀態(tài)，如何對(duì)萎縮的牙槽骨成功進(jìn)行擴(kuò)增，是很多種植科臨床醫(yī)生關(guān)注的問(wèn)題。
　　 本研究從外周血中獲得可以作為骨組織工程種子細(xì)胞的PB-MSCs；改良了殼聚糖凝膠使其能良好的保持種子細(xì)胞的活力；利用這兩者構(gòu)建一種可注射組織工程骨，應(yīng)用到骨質(zhì)疏松兔種植體周?chē)?，結(jié)果該可注射組織工程骨在種植體骨外懸空部分周?chē)纬闪诵律墙M織與種植體緊密接觸，在種植體骨內(nèi)部分近心端形成較強(qiáng)的白色阻射影像。這提示該可注射組織工程骨在體內(nèi)可以形

3、成新生骨組織，既可以用于牙槽骨擴(kuò)增術(shù)，也可以提高骨質(zhì)疏松狀態(tài)下BD、BA，進(jìn)一步詳細(xì)的深入研究有待以后進(jìn)行。
　　 實(shí)驗(yàn)一骨髓與外周血間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞的體外培養(yǎng)
　　 目的：研究外周血是否可以與骨髓一樣作為骨組織工程種子細(xì)胞來(lái)源。
　　 方法：自腹主動(dòng)脈抽取1月齡左右新西蘭兔外周血，密度離心法分離兔外周血單個(gè)核細(xì)胞，沖洗收集長(zhǎng)骨內(nèi)骨髓，將兩者在體外進(jìn)行培養(yǎng)。取P4代細(xì)胞，利用RT-PCR法檢測(cè)表面分子標(biāo)志物表達(dá)情況

4、；進(jìn)行成脂誘導(dǎo)，油紅0染色觀察脂滴形成情況；進(jìn)行成骨誘導(dǎo)，組織學(xué)染色觀察ALP、I型膠原的表達(dá)及礦化結(jié)節(jié)形成情況。
　　 結(jié)果：骨髓原代培養(yǎng)細(xì)胞集落形成早，細(xì)胞形態(tài)均一，呈典型的成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞，CD29表達(dá)陽(yáng)性，CD34表達(dá)陰性。成脂誘導(dǎo)時(shí)大部分分化為脂肪細(xì)胞。成骨誘導(dǎo)1w時(shí)ALP表達(dá)陽(yáng)性，3w時(shí)I型膠原表達(dá)陽(yáng)性，4w時(shí)形成數(shù)量較多的礦化結(jié)節(jié)。外周血原代培養(yǎng)細(xì)胞集落形成晚，細(xì)胞形態(tài)不一，種類(lèi)多。細(xì)胞CD29表達(dá)陽(yáng)性，CD34表

5、達(dá)弱陽(yáng)性。成脂誘導(dǎo)10d時(shí)部分細(xì)胞分化為脂肪細(xì)胞。成骨誘導(dǎo)2w時(shí)ALP表達(dá)陽(yáng)性、4w時(shí)I型膠原表達(dá)陽(yáng)性，5w時(shí)有礦化結(jié)節(jié)形成，同時(shí)有管樣結(jié)構(gòu)形成。
　　 結(jié)論：外周血內(nèi)含有多向分化潛能干細(xì)胞，成骨誘導(dǎo)時(shí)能分化為成骨細(xì)胞并形成礦化結(jié)節(jié)。外周血可以作為組織工程骨的種子細(xì)胞來(lái)源。
　　 實(shí)驗(yàn)二一種細(xì)胞活性保持良好的殼聚糖凝膠的制備
　　 目的：通過(guò)減少鹽酸的濃度，升高殼聚糖溶液的PH值，減少交聯(lián)劑β-GP用量，使殼聚糖

6、凝膠具有生理滲透壓，更好的保持細(xì)胞活性。
　　 材料與方法：用不同濃度鹽酸配制2％殼聚糖溶液：A組，0.1M；B組，0.09M；C組，0.08M；D組，0.07M；E組，0.07M；A-D組常溫?cái)嚢枞芙?，E組高溫?cái)嚢枞芙?。持續(xù)攪拌6h后高溫高壓消毒。β-GP溶液分為3種濃度(w/v)：I組，11％；II組，25％；III組，50％。4ml殼聚糖溶液與1mlβ-GP溶液混勻組成殼聚糖凝膠，測(cè)量不同組分殼聚糖凝膠PH值并記錄其在37

7、℃時(shí)凝固所需時(shí)間。取E+I、D+II、D+III三組凝膠與外周血間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞混合凝固后體外培養(yǎng)3d，利用MTT檢測(cè)凝膠內(nèi)細(xì)胞活力保持情況。
　　 結(jié)果：鹽酸濃度越低，消毒造成的殼聚糖溶液粘度損失越小，所獲得的殼聚糖凝膠PH值越高，由不凝固變?yōu)槟袒蚰趟钑r(shí)間越短。E+I組凝膠中大多數(shù)細(xì)胞具有活性，D+II組凝膠中少數(shù)細(xì)胞具有活性，D+III凝膠中只有個(gè)別細(xì)胞具有活性。
　　 結(jié)論：E+I組凝膠合2.2％β-GP，具備

8、生理滲透壓，PH值為7.13，凝固時(shí)間為20min，能很好的保持細(xì)胞的活性。
　　 實(shí)驗(yàn)三去勢(shì)法骨質(zhì)疏松兔模型的建立及下頜牙槽骨的改變
　　 目的：去勢(shì)法建立兔骨質(zhì)疏松模型并觀察下頜牙槽骨的改變。
　　 方法：20只雌性新西蘭兔平均隨機(jī)分為兩組，手術(shù)組行雙側(cè)卵巢摘除術(shù)，對(duì)照組行假手術(shù).檢測(cè)術(shù)前及術(shù)后3m、6m血清中OC與TRAP水平、股骨與腰椎BMD。術(shù)后6m處死所有實(shí)驗(yàn)用兔，下頜骨脫礦后制作5μm切片，組織學(xué)染

9、色觀察頦孔附近骨形態(tài)，光鏡下測(cè)量下頜中切牙內(nèi)側(cè)骨層厚度，拍片后使用photoshop軟件計(jì)算下頜中切牙下方內(nèi)側(cè)骨面積比例。
　　 結(jié)果：手術(shù)組OC水平術(shù)后3m(3.39±0.63μg/L)、6m(3.22±0.98μg/L)高于假手術(shù)組(2.46±0.68μg/L；2.17±0.57μg/L，P<0.05)；TRAP術(shù)后3m(OD值0.389±0.061)、6m(OD值0.371±0.051)高于假手術(shù)組(OD值：0.332±0

10、.039；0.308±0.029，P<0.05)。術(shù)后3m兩組的股骨、腰椎BMD無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異.術(shù)后6m手術(shù)組股骨BMD(0.349±0.056g/cm3)、腰椎BMD(0.257±0.042g/cm3)均低于假手術(shù)組(股骨0.481±0.086g/cm3，P<0.01；腰椎0.360±0.042g/cm3，P<0.01)。術(shù)后6m手術(shù)組下頜骨松質(zhì)骨內(nèi)骨小梁變細(xì)，排列稀疏甚至消失，手術(shù)組下頜中切牙內(nèi)側(cè)骨層厚度(0.52±0.16mm)較假

11、手術(shù)組(0.85±0.14mm，P<0.01)變??；中切牙內(nèi)下方骨小梁面積比(51.7±11.6％)明顯低于假手術(shù)組(82.6±9.2％，P<0.01)。
　　 結(jié)論：去勢(shì)法兔骨質(zhì)疏松模型成熟可靠。下頜牙槽骨表現(xiàn)出明顯的骨質(zhì)疏松樣改變，提示骨質(zhì)疏松狀態(tài)下進(jìn)行種植牙治療有必要采取一些特殊措施來(lái)保證治療的成功。
　　 實(shí)驗(yàn)四可注射組織工程骨用于骨質(zhì)疏松種植修復(fù)的初步探索
　　 目的：將可注射組織工程骨安全有效的應(yīng)用于

12、種植體研究，初步觀察其在骨質(zhì)疏松狀態(tài)下修復(fù)種植體周?chē)橇坎蛔愕男Ч?br>　　 方法：(1)9只正常新西蘭兔分為3組，每組3只，將1ml E+I配制的殼聚糖凝膠按照不同方式應(yīng)用于種植部位骨內(nèi)：第一組種植窩制備前注入；第二組種植窩制備后注入，并迅速植入種植體；第三組將殼聚糖凝膠凝固后置入種植窩。觀察2h內(nèi)實(shí)驗(yàn)用兔反應(yīng)。(2)用自體PB-MSCs與E+I配制的殼聚糖凝膠構(gòu)建可注射組織工程骨。所用種植體為BAM表面羥基磷灰石涂層的圓柱狀無(wú)

13、螺紋種植體，植入股骨干骺端。12只骨質(zhì)疏松兔分為3組，每組4只?？瞻讓?duì)照組單純植入種植體；對(duì)照組種植體骨內(nèi)周?chē)肮峭鈶铱詹糠謶?yīng)用殼聚糖凝膠；實(shí)驗(yàn)組種植體骨內(nèi)周?chē)肮峭鈶铱詹糠謶?yīng)用可注射組織工程骨。術(shù)后10w處死所有骨質(zhì)疏松兔取材，觀察種植體懸空部分周?chē)鹿切纬汕闆r。X片觀察種植體骨內(nèi)部分近心端的X線阻射情況。
　　 結(jié)果：(1)所有第一組新西蘭兔在殼聚糖凝膠注射后10-30min內(nèi)死亡。第二組、第三組新西蘭兔無(wú)死亡.(2)空白對(duì)

14、照組與大部分對(duì)照組種植體懸空部分周?chē)鸁o(wú)骨組織；實(shí)驗(yàn)組種植體懸空部分周?chē)胁煌潭鹊男律墙M織形成并與種植體緊密相接?？瞻讓?duì)照組種植體近心端無(wú)X線阻射影；對(duì)照組部分標(biāo)本種植體近心端有少量模糊的白色阻射影；實(shí)驗(yàn)組在種植體近心端有較強(qiáng)條紋狀或蜂窩狀的白色阻射影，提示有較多骨形成。
　　 結(jié)論：在生理?xiàng)l件下可以自發(fā)凝固的可注射凝膠直接注射入封閉的骨組織內(nèi)有很高的風(fēng)險(xiǎn)?？勺⑸浣M織工程骨既能在種植體骨外懸空部分周?chē)纬尚律墙M織，也能在種植