復(fù)合富血小板血漿可注射型組織工程骨的構(gòu)建與實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的： 1．探討殼聚糖-β-磷酸三鈣生物材料作為可注射組織工程骨支架料的可行性、生物相容性，以及富血小板血漿(platelet-rich plasma， PRP)作為可注射組織工程材料生長因子的可行性。 2．研究PRP對(duì)MSCs成骨分化的直接作用以及經(jīng)PRP誘導(dǎo)后的MSCs其增殖活性、成骨分化特性，探討PRP的成骨修復(fù)作用機(jī)制。 3．制各適合可注射骨應(yīng)用的中國青山羊脛骨洞型缺損模型。 4．研究新型可注射型

2、組織工程骨殼聚糖-β-磷酸三鈣(β-TCP)/PRP/骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells，MSCs)對(duì)青山羊脛骨洞型骨缺損的修復(fù)能力。 方法： 1．將中國青山羊MSCs體外培養(yǎng)并經(jīng)地塞米松誘導(dǎo)，取第三代MSCs用于試驗(yàn)。將固化后的殼聚糖-β-磷酸三鈣與MSCs體外復(fù)合培養(yǎng)，分為空白對(duì)照組和材料組，MTT法進(jìn)行細(xì)胞增殖檢測(cè)，倒置相差顯微鏡進(jìn)行細(xì)胞行態(tài)學(xué)觀察，評(píng)價(jià)可注射材料

3、的細(xì)胞相容性；將液相的殼聚糖-β-磷酸三鈣與MSCs混合，待固化成形后切成小塊，體外培養(yǎng)后，掃描電鏡觀察細(xì)胞生長情況，評(píng)價(jià)殼聚糖-β-磷酸三鈣作為可注射組織工程骨支架料的可行性。另將體外培養(yǎng)的第3代MSCs用于實(shí)驗(yàn)，將PRP與可注射材料混合，分為空白對(duì)照組、單純材料組、材料/PRP組，MTT法進(jìn)行細(xì)胞增殖檢測(cè)，倒置相差顯微鏡進(jìn)行細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察，評(píng)價(jià)PRP作為可注射材料的生長因子的可行性。 2．采用人和青山羊的MSCs，分為單純血

4、清培養(yǎng)組、DEX誘導(dǎo)組、PRP誘導(dǎo)組，通過堿性磷酸酶染色、鈣沉積染色評(píng)價(jià)PRP對(duì)堿性磷酸酶、鈣沉積的影響，采用人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(humarl bone marrow mesellchymal stem cells HMSCs)，通過半定量RT-PCR檢測(cè)的PRP對(duì)HMSCs的堿性磷酸酶(A1kaline phosphatase，ALP)、骨連接蛋白(osteoIleetin，0N)、骨鈣素(Osteocalcin， OC)、Ⅰ型膠原(

5、Collagen type Ⅰ，Col1-Ⅰ)、中心結(jié)合因子(core binding factor alpha 1 Cbfal)、 TGF-β1 (transformi ng growth factor betal TGF-β1)基因的表達(dá)影響，評(píng)價(jià)PRP對(duì)MSCs的成骨分化的誘導(dǎo)作用。 3．將PRP誘導(dǎo)后的HMSCs和未誘導(dǎo)的HMSCs分為兩組，通過MTT法進(jìn)行細(xì)胞增殖檢測(cè)，倒置相差顯微鏡進(jìn)行細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察，評(píng)價(jià)PRP誘導(dǎo)后

6、的HMSCs增殖活性；以未誘導(dǎo)的HMSCs單純血清培養(yǎng)為對(duì)照組，PRP誘導(dǎo)后的HMSCs單純血清培養(yǎng)為PRP組，PRP誘導(dǎo)后的HMSCs進(jìn)行DEX誘導(dǎo)為DEX組，通過堿性磷酸酶染色、鈣沉積染色、半定量RT-PCR檢測(cè)HMSCs的ALP、OC、ON、Coll-Ⅰ、 Cbfal、TGF-β1基因的表達(dá)來評(píng)價(jià)PRP誘導(dǎo)過的HMSCs成骨分化的能力。 4．于中國青山羊雙側(cè)脛骨內(nèi)側(cè)平臺(tái)下制作直徑1.2cm的圓洞型骨缺損，術(shù)后4、8w，通過

7、X片觀察、硬組織切片形組織學(xué)觀察，圖像分析評(píng)價(jià)可注射骨用中國青山羊脛骨洞型缺損動(dòng)物模型的可靠性。 5．采用中國青山羊雙側(cè)脛骨平臺(tái)下圓洞型骨缺損模型。30只中國青山羊隨機(jī)分為5組：空白組：骨缺損部不植入任何組織工程材料；單純材料組：單純植入組織工程材料殼聚糖B一磷酸三鈣；PRP組：植入單純復(fù)合PRP的組織工程材料；MSCs組：植入單純復(fù)合MSCs的組織工程材料；PRP/MSCs組：植入復(fù)合PRP、MSCs的組織工程材料。于術(shù)后第4

8、、8W取出骨缺損區(qū)標(biāo)本進(jìn)行大體觀察和組織學(xué)切片觀察，圖像分析骨缺損區(qū)域新生骨組織的生成比例，評(píng)價(jià)可注射工程骨的體內(nèi)骨修復(fù)能力。 結(jié)果： 1.倒置相差顯微鏡下殼聚糖-β-TCP材料組細(xì)胞生長良好，與空白對(duì)照組無明顯差異，細(xì)胞形態(tài)正常。隨培養(yǎng)時(shí)間的延長，各組D570值逐漸增加，到第8d達(dá)最高。 2.倒置相差顯微鏡觀察殼聚糖-β-TCP/PRP組材料周邊細(xì)胞生長較快，6d～7d時(shí)匯合成單層；材料組細(xì)胞生長與對(duì)照組相似，

9、8d～10d細(xì)胞匯合成單層，所有組細(xì)胞形態(tài)正常。 3.培養(yǎng)后第7d，同F(xiàn)CS組相比，PRP同時(shí)明顯減少了HMSCs和羊MSCs ALP陽性細(xì)胞數(shù)，然而DEX明顯增加了ALP陽性細(xì)胞數(shù)。 4.第2、4、6、8d的D570值，F(xiàn)CS組分別為0.149±0.039、0.405±0.063、0.933+0.048、1.161+0.057，經(jīng)PRP誘導(dǎo)后的MSCs(PRP 組)分別為0.152±0.028、0.397±0.035、

10、0.964±0.033、1.03±0.061，PRP組(均數(shù)為0.654)與對(duì)照組之間(均數(shù)為0.662)比較無顯著性差異(F=0.311，P=0.580)。 5.x片顯示術(shù)后4w實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物骨缺損處均未見有明顯密度增高區(qū)，術(shù)后8w骨缺損邊緣有少量密度增高區(qū)，缺損中間無骨密度增高；實(shí)驗(yàn)組4w取材時(shí)大體標(biāo)本顯示骨缺損周邊無明顯骨組織形成，缺損部由纖維組織填充；術(shù)后8w骨缺損邊緣有少量新骨形成，但無骨痂生長，骨缺損部仍為纖維組織填充。

11、 6.大體觀察顯示4w時(shí)各組表面有一層菲薄的纖維組織包裹，空白組骨缺損部硬度低于單純材料組，PRP組、MSCs組硬度略高于單純材料組，而PRP/MSCs組硬度最高，除空白組外，其余三組均可見骨缺損部未降解的材料。 結(jié)論： 1.MSCs/殼聚糖-β-TCP復(fù)合物表面細(xì)胞增殖良好，該生物材料具有良好的細(xì)胞相容性，可作為可注射型骨組織支架材料。復(fù)合材料中的PRP能促進(jìn)體外培養(yǎng)的MSCs增殖，PRP作為可注射性材料殼聚糖

12、-β-TCP中的生長因子是可行的。 2．PRP對(duì)MSCs的直接效應(yīng)是抑制成骨分化；PRP誘導(dǎo)后的HMSCs能恢復(fù)到正常的增殖速率，在體內(nèi)應(yīng)用是安全的；PRP誘導(dǎo)后的HMSCs具有與正常HMSCs相同的成骨分化能力，在體外仍可經(jīng)DEX誘導(dǎo)向成骨細(xì)胞分化，PRP誘導(dǎo)后的HMSCs仍能維持較強(qiáng)的成骨分化活性；在PRP的直接作用下，HMSCs的TGF-β1基因表達(dá)增高，而且在PRP作用后的HMSCs仍能維持較高的TGF-β1分泌，這可能