富血小板血漿應(yīng)用于兔顱骨組織工程的實驗研究.pdf

1、目的：口腔頜面部經(jīng)常需要進行大塊的骨缺損修復(fù)。自體骨移植來源有限并造成供區(qū)創(chuàng)傷,異體骨移植可能傳播疾病或存在免疫反應(yīng)。組織工程(tissue engineering,TE)能進行有效的骨組織重建而成為修復(fù)骨缺損的最有前景的方法。骨組織工程通常是將體外培養(yǎng)的骨髓基質(zhì)細胞(bone marrow stromal cells,BMSCs)接種在組織工程支架上,而后植入骨缺損區(qū)。BMSCs體外培養(yǎng)的培養(yǎng)基中需加入動物血清作為提供各種營養(yǎng)和細胞因

2、子的必須物質(zhì),動物血清可能引起免疫反應(yīng)和疾病傳播等問題。盡管有學(xué)者嘗試過采用無血清培養(yǎng)基,但結(jié)果并不理想。富血小板血漿(platelet rich plasma,PRP)來源于自體,排除了免疫反應(yīng)的可能,有望取代以前用動物血清培養(yǎng)而可能帶來的免疫反應(yīng)和疾病傳播等問題,從而解決了骨組織工程的相關(guān)難題。
　　 在組織工程領(lǐng)域,生長因子的作用越來越多地受到關(guān)注和重視。PRP中的血小板在凝血酶的作用下發(fā)生脫顆粒反應(yīng)而釋放各種生長因子,這

3、些生長因子比例協(xié)調(diào),能產(chǎn)生最有效的相互作用,從而促進骨組織的再生。結(jié)構(gòu)上,PRP與常用于組織工程的纖維膠及藻酸鹽相似,能為細胞提供三維的生長環(huán)境。PRP正在成為組織工程新的熱點而被臨床醫(yī)生和研究學(xué)者所重視。盡管PRP復(fù)合其它支架材料在組織工程中已有應(yīng)用,其單獨作為骨組織工程的支架還很少報道。
　　 本研究對比分析不同制備方法及不同存放時間對富血小板血漿的影響,探討PRP對培養(yǎng)、誘導(dǎo)兔骨髓基質(zhì)細胞成骨活性的影響,并在分析PRP微觀

4、結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上,利用PRP凝膠作為支架復(fù)合經(jīng)過地塞米松誘導(dǎo)或未經(jīng)誘導(dǎo)的BMSCs以及單純的PRP凝膠修復(fù)兔顱骨缺損,以期把PRP作為一種具有良好生物學(xué)活性而且安全、有效的培養(yǎng)基提供給骨組織工程研究與臨床應(yīng)用,并評價來源于自體的PRP凝膠作為骨組織工程支架的可行性,以及PRP在動物體內(nèi)對BMSCs有無誘導(dǎo)功能及其單獨應(yīng)用有無促進成骨的作用,旨在為富血小板血漿在口腔頜面骨組織工程的應(yīng)用奠定初步的理論基礎(chǔ)。
　　 方法：
　　 1

5、、采用不同離心力及離心時間制備PRP,探討不同離心力及離心時間對PRP血小板富集系數(shù)及血小板活化的影響。通過測定不同存放時間后血小板形態(tài)變化及PRP釋放的生長因子數(shù)量,評價不同存放時間對PRP的影響。通過分析PRP凝膠微觀結(jié)構(gòu)、孔隙率等特點,從結(jié)構(gòu)上評價PRP作為骨組織工程支架的可行性。
　　 2、采用密度梯度離心法與全骨髓培養(yǎng)方法分離、培養(yǎng)BMSCs,對比分析兩種方法對兔骨髓基質(zhì)細胞增殖的影響。采用不同濃度自體PRP培養(yǎng)液替代

6、動物血清體外培養(yǎng)BMSCs,探討PRP濃度對BMSCs增殖速度的影響。采用不同濃度PRP單獨或聯(lián)合成骨誘導(dǎo)液培養(yǎng)BMSCs,通過堿性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)染色、鈣結(jié)節(jié)染色及ALP、骨鈣素(osteocalcin,OC)定量測定,評價PRP單獨或聯(lián)合誘導(dǎo)液誘導(dǎo)BMSCs向成骨細胞分化的功能及其與PRP濃度的關(guān)系。
　　 3、在兔顱骨制備直徑為5mm的全層骨缺損區(qū),利用PRP凝膠作為支架復(fù)合經(jīng)過地

7、塞米松誘導(dǎo)的或未經(jīng)誘導(dǎo)的BMSCs,全血復(fù)合經(jīng)過地塞米松誘導(dǎo)的或未經(jīng)誘導(dǎo)的BMSCs以及單純的PRP凝膠修復(fù)兔的顱骨缺損。8周后,分離顱骨標(biāo)本。通過大體檢查、拍攝X線片、計算骨修復(fù)區(qū)與相鄰正常顱骨的骨密度評分比值、組織學(xué)檢測等方法分析缺損區(qū)骨修復(fù)情況。以評價來源于自體的PRP凝膠作為骨組織工程支架的可行性及PRP在動物體內(nèi)對BMSCs有無誘導(dǎo)功能及其單獨應(yīng)用有無促進成骨的作用。
　　 結(jié)果：
　　 1、離心制備PRP時,

8、采用兩次離心法,每次離心力200g、離心時間10分鐘能在保證血小板質(zhì)量的同時,獲得較高的血小板富集系數(shù)。隨存放時間延長,PRP中血小板形態(tài)上逐漸呈現(xiàn)出活化的趨勢,但并未影響轉(zhuǎn)化生長因子-β(transforminggrowth factor-β,TGF-β)和血小板衍生生長因子(platelet-derived growth factor,PDGF)的釋放。PRP凝膠有大量孔隙,孔隙率為84.12％,電鏡下可見孔隙的直徑從數(shù)十微米至數(shù)百

9、微米不等,各孔隙互相交通。
　　 2、PRP培養(yǎng)液能夠促進BMSCs增殖,且與PRP培養(yǎng)液濃度成負相關(guān)。BMSCs經(jīng)PRP培養(yǎng)液培養(yǎng)后,ALP染色及鈣結(jié)節(jié)染色呈陰性。PRP與誘導(dǎo)液聯(lián)合培養(yǎng)BMSCs,ALP染色陽性率顯著提高。先行PRP培養(yǎng)液培養(yǎng)而后以成骨誘導(dǎo)液誘導(dǎo)BMSCs明顯增加ALP染色陽性率。單純高濃度PRP培養(yǎng)液培養(yǎng)的BMSCs表達ALP及OC減少,不同濃度PRP培養(yǎng)液加入誘導(dǎo)劑后,BMSCs表達ALP及OC明顯增加,

10、而且低濃度組增加更顯著。表明單純高濃度PRP培養(yǎng)液抑制BMSCs向成骨細胞分化,但不同濃度PRP均增強地塞米松對BMSCs的誘導(dǎo)作用,而低濃度PRP的此種作用更強。
　　 3、手術(shù)8周后,以PRP/BMSCs(經(jīng)成骨誘導(dǎo)液誘導(dǎo))復(fù)合物凝膠修復(fù)的兔顱骨缺損區(qū)有大量新骨形成,在整個骨缺損區(qū)分布均勻。以PRP/BMSCs(未經(jīng)成骨誘導(dǎo)液誘導(dǎo))復(fù)合物凝膠植入的骨缺損區(qū),新骨數(shù)量較少。單純PRP凝膠植入的骨缺損區(qū)新骨數(shù)量更少,分布不均,多

11、位于缺損區(qū)周邊。而以全血復(fù)合BMSCs植入的骨缺損區(qū),無論BMSCs是否經(jīng)過成骨誘導(dǎo)液誘導(dǎo),其鏡下表現(xiàn)與空白對照組相似,未觀察到新形成的骨組織。
　　 結(jié)論：
　　 1、離心制備PRP時,采用兩次離心法,每次離心力200g、離心時間10分鐘是制備PRP合適的方法。術(shù)前制備PRP在室溫條件存放12小時至36小時并未影響TGF-β1和PDGF釋放,是可行的。
　　 2、PRP培養(yǎng)液可促進BMSCs增殖而以低濃度PRP

12、促進BMSCs增殖更明顯。PRP不具有誘導(dǎo)BMSCs向成骨細胞分化的功能,但能促進成骨誘導(dǎo)液誘導(dǎo)BMSCs向成骨細胞分化。并且這種促進作用以低濃度PRP更強,先行加入PRP培養(yǎng)液的效果更顯著。
　　 3、PRP凝膠有大量微孔,彼此互相交通,PRP復(fù)合經(jīng)過誘導(dǎo)的BMSCs可成功修復(fù)兔顱骨全層缺損,可以用作骨組織工程的支架。
　　 4、PRP在動物體內(nèi)具有促進新骨生成的能力,但誘導(dǎo)BMSCs向成骨細胞分化的能力有限。當(dāng)采用P