骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞膜片復(fù)合富血小板血漿應(yīng)用于腰椎后外側(cè)融合的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：
　　骨組織工程的出現(xiàn)為脊柱融合中的骨移植提供了合適的替代物。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)具有多向分化潛能且能定向分化，易獲取，對(duì)機(jī)體損傷小，易于體外增殖，長期傳代而不改變生物學(xué)特性，組織相容性好，組織修復(fù)能力強(qiáng)等特性，成為組織工程的理想種子細(xì)胞。細(xì)胞膜片技術(shù)避免了收集過程中對(duì)細(xì)胞進(jìn)行消化等有創(chuàng)處理，保持了細(xì)胞活性和數(shù)量，保留了重要的細(xì)胞表面蛋白和細(xì)胞外基質(zhì)，這使膜片移植入體內(nèi)后，能迅速有效的發(fā)揮成骨及細(xì)胞因子分泌等作用。

2、富血小板血漿(PRP)是全血經(jīng)過濃集、分離而得到的血液制品，因其含有多種高濃度的促進(jìn)骨組織、軟組織和血管再生的誘導(dǎo)因子，從而成為一種重要的成骨誘導(dǎo)物。
　　本研究利用無需特殊設(shè)備的簡單刮擦方法獲取BMSCs膜片，并復(fù)合PRP構(gòu)建無載體組織工程膜片，進(jìn)行脊柱后外側(cè)融合，評(píng)價(jià)融合效果，評(píng)估新型組織工程骨的臨床可行性。
　　方法：
　　細(xì)胞取自1月齡新西蘭大耳白兔，利用全骨髓法進(jìn)行BMSCs的分離和原代培養(yǎng)，之后進(jìn)行細(xì)胞的傳

3、代培養(yǎng)，細(xì)胞鑒定，細(xì)胞活力和細(xì)胞增殖檢測及成骨誘導(dǎo)分化，并獲得BMSCs膜片，對(duì)膜片行形態(tài)學(xué)觀察和成骨能力的評(píng)價(jià)。提取實(shí)驗(yàn)動(dòng)物自體PRP并激活，構(gòu)建BMSCs/PRP無載體組織工程化膜片。
　　動(dòng)物模型采用健康4月齡新西蘭大耳白兔，隨機(jī)分為4組，每組6只:BMSCs/PRP組;BMSCs組;自體髂骨組;空白對(duì)照組，行脊柱融合手術(shù)。術(shù)后8周處死實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，取脊柱標(biāo)本，進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)檢測，評(píng)價(jià)各組脊柱融合效果。
　　結(jié)果：
　

4、　流式細(xì)胞分析及細(xì)胞表面標(biāo)志物CD44，CD90的免疫熒光染色證明了所培養(yǎng)的細(xì)胞為BMSCs。臺(tái)盼藍(lán)細(xì)胞活力檢測示誘導(dǎo)與未誘導(dǎo)組細(xì)胞活力無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=1.000)。誘導(dǎo)組與未誘導(dǎo)組增殖無明顯差異。
　　誘導(dǎo)后BMSCs行形態(tài)學(xué)相關(guān)檢測示其向成骨細(xì)胞分化，具有成骨能力，且間接證明所培養(yǎng)的細(xì)胞為BMSCs。誘導(dǎo)后BMSCs經(jīng)3周培養(yǎng)，形成細(xì)胞膜片，利用細(xì)胞刮刀，將膜片與培養(yǎng)皿分離。膜片茜素紅染色示大量鈣結(jié)節(jié)形成，免疫熒光示COL-

5、Ⅰ表達(dá)，證明其成骨能力。Real-Time PCR檢測示經(jīng)誘導(dǎo)后BMSCs出現(xiàn)了成骨細(xì)胞的基因表型。
　　本研究共構(gòu)建動(dòng)物模型24只，大體觀察示BMSCs/PRP組中所有動(dòng)物左側(cè)L5—L6橫突間均存在塊狀連接物，其表面較粗糙，有膜性結(jié)構(gòu)包被，橫突間部分觸之堅(jiān)硬。BMSCs組有1只動(dòng)物左側(cè)L5—L6橫突間存在塊狀連接物，但橫突間部分觸之較薄，且較柔韌，另有1只動(dòng)物左側(cè)L5、L6橫突增寬，但未連接，其余4只動(dòng)物L(fēng)5— L6橫突間未形成

6、連接，橫突無明顯變化。自體髂骨組有5只動(dòng)物左側(cè)L5— L6橫突間存在塊狀連接物，形態(tài)、觸感同BMSCs/PRP組，另有1只動(dòng)物L(fēng)5、L6橫突增寬，但未連接?？瞻讓?duì)照組所有動(dòng)物左側(cè)L5—L6橫突間均未形成連接，橫突無明顯變化。手法檢測發(fā)現(xiàn)BMSCs/PRP組融合率最高，但與自體髂骨組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=1.000)，與BMSCs組和空白對(duì)照組均存在顯著差異(P=0.001，P=0.001)。DR片示BMSCs/PRP組所有動(dòng)物左側(cè)L5— L

7、6橫突間均呈現(xiàn)高密度影，密度不均，大小不等，形狀不規(guī)則，均有連續(xù)骨小梁通過兩橫突間。BMSCs組有1只動(dòng)物左側(cè)L5—L6橫突間存在低密度影，但無連續(xù)骨小梁通過兩橫突間，另有一只動(dòng)物L(fēng)5、L6橫突增寬，其余動(dòng)物L(fēng)5—L6橫突間無成骨，L5、L6橫突無變化。自體髂骨組有5只動(dòng)物左側(cè)L5—L6橫突間影像表現(xiàn)同BMSCs/PRP組，另有一只動(dòng)物L(fēng)5、L6橫突增寬?？瞻讓?duì)照組所有動(dòng)物橫突間均無成骨，橫突無變化。隨機(jī)取BMSCs/PRP組和自體髂骨

8、組各1只融合標(biāo)本行CT掃描和脊柱三維重建，示L5—L6橫突間有成骨，成骨塊連續(xù)通過橫突間隙，表面粗糙，成骨密度較高但不均勻。組織學(xué)檢測結(jié)果顯示BMSCs/PRP組和自體髂骨組融合標(biāo)本橫突間有成熟骨組織，骨小梁連續(xù)，并有髓腔出現(xiàn)，內(nèi)有骨髓組織。
　　結(jié)論：
　　利用全骨髓法來獲得BMSCs，方便可行，純度較高。簡單刮擦法是獲取細(xì)胞膜片的有效途徑，獲得的膜片具有一定的可操作性，具有良好的成骨能力。PRP具有良好的成骨誘導(dǎo)作用。利